拉魯濕地土壤理化因子與酵母菌多樣性及產胞外酶活性相關性分析

郭小芳 熊寧 郝兆 梁澤鵬 拉巴

（西藏大學理學院 西藏拉薩 850000）

拉魯濕地土壤理化因子與酵母菌多樣性及產胞外酶活性相關性分析

郭小芳 熊寧 郝兆 梁澤鵬 拉巴

（西藏大學理學院 西藏拉薩 850000）

采用稀釋倒平板法從拉魯濕地土壤中分離酵母菌，結合經典分類法及26S rDNA D1/D2區域序列分析，對獲得的83株酵母菌菌株進行系統分類，并對土壤的基本理化因子進行了測定。結果顯示，拉魯濕地土壤酵母菌分屬于隱球酵母屬Cryptococcus、假絲酵母屬Candida、原囊菌屬Protomyces、紅酵母屬Rhodotorula及Cystofilobasidium 5個屬16個種，其中隱球酵母屬Cryptococcus包括8個種。多樣性指數比較結果表明，6號樣點酵母菌多樣性最豐富，9號樣點最低。理化因子測定結果顯示，不同樣點所測的6種理化因子存在一定程度的差異，其中6號樣點水分含量明顯高于其他樣點（P＜0.05），3號樣點銨態氮、速效磷以及速效鉀含量最高（P＜0.05），9號樣點則最低（P＜0.05）；3、4、5、6號樣點有機質含量明顯高于其他幾個樣點（P＜0.05）。酵母菌多樣性與理化因子相關性分析結果表明，兩者之間沒有顯著相關性，而有機質含量與酵母菌總豐度相關性系數較高。產不同胞外酶活性菌株比例與土壤理化因子間不呈現顯著相關性，果膠酶活性菌株比例與水分呈現顯著負相關性（P＜0.05），速效磷與產脂肪酶活性菌株比例則呈現顯著正相關性（P＜0.05）。

拉魯濕地；土壤；酵母菌多樣性；理化因子；26SrDNAD1/D2區域序列分析

濕地為水生、陸生生態系統界面相互延伸擴展的重疊空間區域，是地球上特殊過渡類型生態系統，也是自然界富有生物多樣性的生態景觀和人類重要的生存環境之一，具有多種生態功能和社會經濟價值，被譽為“自然之腎”[1]。微生物不僅在濕地生態系統物質循環、能量流動和系統穩定性維持等方面具有重要作用，此外還參與廢物處理、生態修復、氣體調節和生物多樣性保護等生態過程[2]。拉魯濕地是目前我國城市范圍內面積最大的天然濕地，在保持地區生物多樣性、維持城市生態平衡、改善城市環境質量等方面起著十分重要的作用，故有拉薩“城市之肺”之稱[3-4]。盡管拉魯濕地具有重要的生態作用，但是由于受地域等條件的限制，對其中生物資源和多樣性的研究起步較晚，且主要集中在動物[5-12]和植物[13-15]群落結構方面的研究，在微生物方面，僅見的零星報道也只是局限于土壤放線菌和細菌的研究[16-17]。本實驗對拉魯濕地土壤理化因子進行測定，并就其與酵母菌多樣性、產胞外酶活性菌株分布特性相關性進行分析，旨在為拉魯濕地生物多樣性研究提供理論依據。

1 研究內容與方法

1.1 土壤樣品的采集

在拉魯濕地選擇具有代表性的10個生境樣點，進行土壤的采集。采用多點混合法采集0～30cm深度的土壤樣品，并在4℃下保藏備用。

1.2 土壤理化因子測定

測定土壤pH值、水分、銨態氮、速效磷、速效鉀及有機質含量。采用烘干法提取水分，pH計測定土壤的pH值，其他理化指標的測定采用土壤化肥速測儀TRF-1進行。

1.2.1 土壤水分的測定

稱取100g土壤，將其烘干至恒重。稱量烘干土壤重量，并計算樣品水分含量。重復測定三次。

1.2.2 土壤pH的測定

稱取過20目篩的風干土壤10g，置于100mL燒杯中；量取50mL蒸餾水，加入燒杯中；用玻璃棒攪拌約1min，靜置半小時使其澄清；用標準緩沖液校正后的酸度計測定樣品pH值。重復測定3次。

1.2.3 土壤銨態氮的測定

濾液制備：取待測土壤樣品4g放入50mL燒杯中，加蒸餾水20mL；加1g 1號粉后密封燒杯，并搖動10min，過濾后取濾液。

銨態氮測定：向空比色皿內加蒸餾水作為空白液；向空比色皿中滴入18滴蒸餾水，再滴入2滴氮標液，搖勻，做為標準液（20mg/kg）；吸取20滴待測濾液放入空比色皿中，為待測液；向裝有標準液、待測液比色皿內分別加入2滴氮1號試劑，搖勻，再加入2滴氮2號試劑，搖勻。靜止10min后各滴入15滴蒸餾水，上儀器進行測定。每個處理重復3次。

1.2.4 土壤速效磷的測定

濾液制備同1.2.3節。

速效磷測定：向比色皿內加蒸餾水作為空白液；向空的比色皿中滴18滴蒸餾水，再滴入2滴磷標液，搖勻，作為磷標準液（20mg/kg）；吸取16滴蒸餾水、4滴磷濾液加入另一比色皿中搖勻，為待測液；向裝有磷標準液、待測液比色皿內分別滴入15滴蒸餾水，再各加入2滴磷1號試劑和1滴磷2號試劑，立即上儀器進行測定。每個處理重復3次。

1.2.5 土壤速效鉀的測定

濾液制備同1.2.3節。

速效鉀測定：向空的比色皿內加蒸餾水作為空白液；向另一比色皿中滴18滴蒸餾水，再滴2滴鉀標液，搖勻，作為鉀標準液（100mg/kg）；吸取20滴鉀濾液放入另一空的比色皿中，為待測液；向裝有鉀標準液、待測液的比色皿內分別加2滴鉀1號試劑，搖勻，再加2滴鉀2號試劑，搖勻。再各滴15滴蒸餾水，上儀器進行測定。每個處理重復3次。

1.2.6 土壤有機質測定步驟

將5mL測磷浸提濾液倒入小試管中，與說明書上5個標準色標進行比較即可得出土樣有機質的百分含量。5個標準試管分別代表4.0%、3.0%、2.0%、1.0%、0.5%。

1.3 酵母菌的分離及鑒定

采用稀釋涂布法從10個土壤樣品中分離酵母菌。培養基主要包括酸化YPD、酸化YM及酸化PDA平板。采用平板劃線法在YPD培養基上進行酵母菌菌株的純化。分離獲得的酵母菌菌株的鑒定主要采用26SrDNAD1/D2區域序列分析法進行。DNA擴增和檢測等由云南大學微生物研究所完成DNA擴增和條帶檢測后送達測序公司進行測序。序列進行人工校對后在GenBank核酸序列數據庫中進行同源性搜索，以確定酵母菌所屬分類單元。

1.4 產胞外酶活性菌株篩選

采用平皿法進行產胞外酶活性菌株的初步篩選。胞外酶主要包括淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、幾丁質酶及脂肪酶。在不同平板上接種酵母菌菌株后分別于4℃和25℃進行培養。低溫21d、常溫5d時觀察暈圈或透明圈的產生情況，并進行記錄。

1.5 數據的處理及統計

采用Excel軟件計算Shannon-Wiener多樣性指數（H’）、Pielou均勻度指數（J’）及Simpson多樣性指數（D）；用Spss19.0 Duncan檢驗法分析各樣點理化因子差異性，并用其中Pearson分析法進行酵母菌理化因子間、理化因子與酵母菌多樣性指數以及理化因子與產胞外酶活性菌株分布特性相關性分析。

2 結果與分析

2.1 拉魯濕地土壤理化因子測定

表1結果顯示，不同樣點所測的6種理化因子存在一定程度的差異；6號樣點水分含量明顯高于其他樣點（P＜0.05），而2號樣點水分含量最低（P＜0.05）；pH測定結果表明，不同樣點間基本存在顯著差異，其中1號樣點pH最高（P＜0.05），3號樣點則最低（P＜0.05）；3號樣點銨態氮、速效磷以及速效鉀含量最高（P＜0.05），9號樣點則最低（P＜0.05）；有機質含量而言，3、4、5、6號樣點明顯高于其他幾個樣點（P＜0.05），1號、2號和7號樣點則明顯低于其他樣點（P＜0.05）。

表1 拉魯濕地土壤理化因子

2.2 拉魯濕地土壤酵母菌種群分布特性

表2結果顯示，拉魯濕地土壤分離的酵母菌分屬5個屬16種。其中隱球菌屬Cryptococcus種類最多，為8個種，主要包括Cryptococcusadeliensis、Cryptococcusaerius、Cryptococcusaspenensis、Cryptococcuscerealis、Cryptococcusflavus、Cryptococcusfriedmannii、Cryptococcusuzbekistanensis和Cryptococcusvictoriae，其中Cryptococcusvictoriae分布最為廣泛，5個樣點均有分離。其次為紅酵母屬Rhodotorula，包括4個種（Rhodotorula glutinis、Rhodotorula ingeniosa、Rhodotorula mucilaginosa、Rhodotorula vanillica），其中Rhodotorula mucilaginosa相對豐度最高。Cystofilobasidium分離到2個種，原囊菌屬Protomyces和假絲酵母屬Candida均分離到1個種。

表2 拉魯濕地土壤酵母菌種群分布特征

2.3 拉魯濕地土壤酵母菌多樣性指數分析

表3結果顯示，拉魯濕地每個土壤樣品中分離的酵母菌種類不多，最多為3種，最少為1種。10個樣點中，6號樣點可培養酵母菌數量、H’值、D值均最高，而9號樣點以上值均最低?？傮w而言，6號土壤樣點酵母菌相對豐富，其次為2號樣點和7號樣點，9號樣點則比較單一，且數量較少。10個樣點的J’值均不高，最高僅為0.39，說明酵母菌的分布不均勻。

表3 拉魯濕地土壤中酵母菌多樣性指數

2.4 拉魯濕地不同土壤樣點酵母菌產胞外酶活性菌株數比較

表4 拉魯濕地不同樣點土壤酵母菌產胞外酶活性菌株數比較（4℃）

從表4可以看出，4℃條件下，4號、5號和8號樣點具有產幾丁質酶活性菌株；3號、9號和10號樣點產淀粉酶活性菌株比例最高，均為100%；3號和7號樣點產脂肪酶菌株比例最高；5號樣點產果膠酶活性菌株比例最高；2號樣點產纖維素酶活性菌株比例最高。

表5 拉魯濕地不同樣點土壤酵母菌產胞外酶活性菌株數比較（25℃）

表5數據顯示，25℃條件下，2號樣點產淀粉酶活性菌株比例最高；7號樣點產脂肪酶菌株比例最高；而3號樣點產纖維素酶和果膠酶活性菌株比例最高。比較表4和表5數據可以發現，除3號、9號和10號，其他7個樣點高溫條件下的產脂肪酶活性菌株比例均高于低溫條件；除2號樣點外，其他樣點低溫條件下的產淀粉酶活性菌株比例均不低于高溫條件；產纖維素酶活性而言，除6號樣點外，其他樣點低溫條件下活性菌株比例仍均不低于高溫條件；產幾丁質酶活性菌株僅在低溫條件下被分離到。

2.5 拉魯濕地土壤理化因子、酵母菌多樣性及產胞外酶活性間相關性分析

2.5.1 拉魯濕地土壤理化因子間相關性分析分析

表6 拉魯濕地土壤理化因子間Pearson相關性系數

拉魯濕地酵母菌多樣性指數相關性結果顯示（見表6），銨態氮、速效磷與速效鉀間呈顯著或極顯著正相關。銨態氮與水分間呈顯著負相關（P＜0.05）；有機質、pH與其他理化因子之間則無明顯相關性。

表7 拉魯濕地土壤理化因子與酵母菌多樣性指數Pearson相關性系數

2.5.2 拉魯濕地土壤理化因子與酵母菌多樣性指數間相關性分析

理化因子與多樣性指數間相關性分析結果顯示（見表7），拉魯濕地酵母菌物種豐富度、總豐度等多樣性指數與理化因子（pH、水分、銨態氮、速效磷、速效鉀、有機質）之間無明顯相關性，相對而言，酵母總豐度與有機質之間相關性系數較高（0.534）。

表8 拉魯濕地土壤理化因子與不同酵母菌豐度Pearson相關性系數

表9 拉魯濕地土壤理化因子與產不同胞外酶活性菌株比例Pearson相關性系數

2.5.3 拉魯濕地土壤理化因子與不同種酵母菌總豐度相關性分析

表8數據表明，從拉魯濕地土壤中分離到的16種酵母菌總豐度與土壤水分間無明顯相關性；Cryptococcus adeliensis總豐度與pH呈現極顯著正相關（P＜0.01）；Cryptococcus flavus和Rhodotorula glutinis總豐度與銨態氮、速效磷和速效鉀間呈現顯著或極顯著正相關性；Cryptococcusaspenensis總豐度與有機質間呈現極顯著正相關性（P＜0.01）。

2.5.4 拉魯濕地土壤理化因子與產不同胞外酶活性菌株比例相關性分析

從表9可以看出，產不同胞外酶活性菌株比例與土壤理化因子間基本不呈現顯著相關性，但果膠酶活性菌株比例與水分呈現顯著負相關性（P＜0.05），速效磷與產脂肪酶活性菌株比例則呈現顯著正相關性（P＜0.05）。

2.5.5 拉魯濕地不同酵母菌與產不同胞外酶活性菌株比例相關性分析

表10 拉魯濕地不同酵母菌豐度與產不同胞外酶活性菌株比例Pearson相關性系數

表10結果顯示，Cryptococcusflavus與Rhodotorula glutinis豐度與產果膠酶及纖維素酶活性菌株比例間呈現顯著正相關性（P＜0.05），另外，Cryptococcuscerealis豐度與果膠酶產生菌比例也呈現為顯著正相關性（P＜0.05）；Cystofilobasidiummacerans與幾丁質酶產生菌比例間呈顯著正相關性（P＜0.05）。

3 結論和討論

將分離自拉魯濕地土壤的83株酵母菌菌株歸為5個屬16個種，其中隱球酵母屬種類最多，包括8個種。土壤理化因子測定結果表明，6號樣點水分含量明顯高于其他樣點；3號樣點銨態氮、速效磷以及速效鉀含量最高，9號樣點則最低；3、4、5、6號樣點的機質含量明顯高于其他幾個樣點。酵母菌多樣性指數分析結果顯示，6號樣點酵母菌多樣性指數最高，9號樣點酵母菌種類則最為單一。比較6號樣點和9號樣點發現，6號樣點所處生境為以委陵菜Potentilla anserine、嵩草Kobresia sp.為主的草甸群落，受人為干擾較小，而9號樣點則為流沙河入水口形成的沙石沖擊區，前者有機質含量和氮磷鉀等明顯高于后者，因而樣點間酵母菌群落組成存在一定差異。

理化因子間的相關性數據顯示，銨態氮、速效磷與速效鉀間呈顯著或極顯著正相關。理化因子與多樣性指數間相關性分析結果則表明，拉魯濕地酵母菌物種豐富度、總豐度等與理化因子之間無明顯相關性，相對而言，酵母總豐度與有機質之間相關性系數較高，與前期對云南撫仙湖酵母菌多樣性研究[18]的結果相吻合，能夠進一步解釋6號樣點酵母菌總豐度高于9號樣點的可能原因。從本實驗結果看出，微生物群落組成是多種因素共同作用的結果，而微生物群落組成又不免受到人為因素等影響。

為進一步探討不同酵母菌豐度與土壤理化因子的關系，計算了兩者之間的Pearson相關系數，結果表明，速效磷與產脂肪酶活性菌株比例呈現顯著正相關性，這可能與磷酸是脂肪酶作用底物甘油三脂的主要組成成分有關。

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Analysison the correlationsbetween yeastdiversity,extracellularenzymeactivity and physicochemical factorsofsoil in LhaluWetland,Lhasa

Guo Xiao-fang Xiong Ning Hao Zhao Liang Ze-peng Laba
(Schoolof Science，TibetUniversity，Lhasa850000，Tibet)

Pour PlateMethodwasadopted to isolate yeasts from soil in the LhaluWetlandcombiningwith the classical identificationmethod and 26S rDNAD1/D2 sequenceanalysis.83 strainsofyeastwereisolated and soilenvironmental factorsweremeasured.The results showed that isolated yeast from soil in Lhalu wetland was classified into 16 specieswithin 5 generaincluding Cryptococcus,Candida,Protomyces,Rhodotorula and Cystofilobasidium.The diversity index showed that the highest diversity of yeastwas in sample 6 and the lowest insample 9.6 physicochemical factorsmeasured were differentbetween sampling points,thewater content in sample 6was significantly higher than thatofother sampling points(P＜0.05),the concentration ofammonium nitrogen,available phosphorusand available potassium were the highest in sample 3 and the lowest in sample 9(P＜0.05),the organicmatter contentof four samples,including sample 3,4,5 and 6washigher than thatofother samples.The correlation between yeast diversity and physicochemical factors showed that there was no significant correlation between them;however,the correlation coefficientbetween the totalabundance of yeastand the organicmatter contentwas relatively high.Therewas significantnegativecorrelation(P＜0.05)between pectinase activity strain ratio and water contentand significantpositive correlation(P＜0.05)between the proportion of lipase producing strain and available phosphorus.Overall,there were relatively abundant yeast resources in the soil in Lhalu wetland, and yeastcommunity compositionmay affected by physicochemical factorsand human disturbances.

Lhaluwetland;soil;yeastdiversity;physicochemical factors;26SrDNAD1/D2 sequence analysis

10.16249/j.cnki.54-1034/c.2016.02.001

S153.6

A

1005-5738（2016）02-001-009

[責任編輯：索郎桑姆]

2016-09-12

2016年度西藏自治區自然科學基金項目“西藏拉魯濕地水體酵母菌多樣性及其與環境因子相關性研究”（項目號：2016ZR-15-11）；2015年度國家級大學生創新創業訓練項目“拉魯濕地土壤酵母菌分子鑒定及胞外酶活性測定”（項目號：201510694003）；2016年度西藏大學珠峰學者人才發展支持計劃（項目號：藏大字[2016]141號）階段性成果。

郭小芳，女，漢族，甘肅蘭州人，西藏大學理學院副教授，主要研究方向為微生物生態學。