VEGF和MMP—2在卵巢乳頭狀癌組織中表達特征及臨床意義

張永波　胡遠強

[摘 要] 目的：探討卵巢乳頭狀癌組織中VEGF和MMP-2的表達特征，與卵巢乳頭狀癌發生侵襲、轉移的相關性。方法：利用實時定量聚合酶鏈反應（QT-PCR ）、免疫組織化學染色法、Western blot法檢測VEGF/MMP-2基因及蛋白在正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織中的表達情況。結果：與正常卵巢組織相比，在卵巢乳頭狀癌組織中，VEGF/MMP-2基因和蛋白的表達量均明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05 ）。對比I-II期和III-IV期，在III-IV期VEGF/MMP-2基因和蛋白的表達也明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05 ）。結論：VEGF/MMP-2的高表達可能與卵巢乳頭狀癌的侵襲和轉移密切相關。

[關鍵詞] 卵巢乳頭狀癌；VEGF；MMP-2；侵襲和轉移

中圖分類號：R737.31 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）06-111-03

DOI：10.11876/mimt201606041

卵巢癌是女性患者中死亡率最高的一類惡性腫

瘤[1]，最常見的類型是卵巢乳頭狀癌。而卵巢癌高死亡率的主要原因[2]是70%左右的病例確診時已有卵巢癌的浸潤、盆腹腔的轉移，無法手術和放療。腫瘤發生轉移和侵襲的兩個重要環節就是新生血管形成與細胞外基質金屬降解[3]。血管內皮生長因子 （Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種多功能的細胞因子[4-5]，可以增強癌組織中內皮細胞的增生，促進新生血管的形成，同時增加腫瘤中血管的通透性，促進癌細胞進入血管的過程，提高其浸潤和侵襲的能力?；|金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases， MMPs）是一種鋅離子依賴的高度保守的內切蛋白水解酶家族，包括MMP1-MMP26等26個成員，能有效降解血管基底膜及細胞外基質的各種蛋白成分，從而破壞阻礙癌細胞侵襲的組織學屏障[6]。而MMP-2 [7]具有降解基膜Ⅳ型膠原的能力，一直是卵巢乳頭狀癌轉移和浸潤機制的研究熱點。

本實驗利用QT-PCR 法、免疫組織化學染色法、Western blot法檢測VEGF/MMP-2基因及蛋白在正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織中的表達情況，探討其與卵巢乳頭狀癌侵襲、轉移的關系，為下一步研究卵巢乳頭狀癌的早診斷早治療及預后提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

VEGF兔多克隆抗體（武漢博士德有限公司）；MMP-2鼠單克隆抗體（武漢博士德有限公司）；檸檬酸鹽修復液（福州邁新生物技術有限公司）； RNeasy FFPE Tissue Kit試劑盒 （廈門艾德生物醫藥科技有限公司）；Maxima SYBR Green QT-PCR Master Mixes（Thermo Fisher Scientific）；HiFi-MMLV Two Step RT-PCR Kit（北京康為世紀生物科技有限公司）；DL1000Protein Marker （TaKaRa）；組織蛋白提取試劑盒（上海經科化學科技有限公司）；ECL顯色試劑盒（Thermo） ；PBS緩沖液（pH7.2～7.4）（福州邁新生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本來源 收集我院從2013年1月至2015年6月期間具有完整的臨床資料、經手術和病理檢查診斷明確卵巢乳頭狀癌且術前均未行放、化療的病例80例，正常卵巢組織49例。臨床資料包括患者的姓名、年齡、有無浸潤和轉移等。卵巢乳頭狀癌病理診斷由兩位高年資病理醫師復閱切片，不一致病例由第三名醫師進行評估，最后討論達成共識。所有卵巢乳頭狀癌患者臨床分期按國際婦產科聯盟 （FIGO，1988 年）標準，其中I-II期15例，III-IV 期 65例。

1.2.2 總RNA提取，檢測VEGF/MMP-2基因水平的表達情況 收集的正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織石蠟標本，用RNeasy FFPT試劑盒，按照說明書對每一份病例的石蠟標本分別進行總RNA提取。經反轉體系得到cDNA，用QT-PCR方法檢測VEGF/MMP-2基因的表達。QT-PCR條件：底物液12μL，H2O7.5μL ，引物（VEGF/MMP-2/actin）2μL模板2μL。

1.2.3 免疫組織化學染色法檢測VEGF/MMP-2蛋白的表達情況 1）卵巢組織脫蠟和水化；2）抗原修復；3）免疫組織化學染色 ： 3%H2O2滴加在組織上，室溫靜置10min；PBS洗3次各5min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min；滴加一抗50μL， 4℃過夜；PBS洗3次各5min；滴加二抗50μL，37℃20min；PBS洗3次各5min；DAB顯色2-3min，在顯微鏡下掌握染色程度；自來水沖洗5min；蘇木精復染3min，鹽酸酒精分化3s；自來水沖洗10min；脫水、透明、封片、鏡檢。4）結果判讀：VEGF/MMP-2以胞漿出現黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞。陽性結果的判斷標準是按照染色程度和顯色細胞的數量結合進行歸類：細胞顯色比例 < 5%（-）；細胞顯色的比例在 5%～25%之間，呈現為淡黃色（+）；細胞顯色的比例在25%～50%之間，呈現為黃色（++）；細胞顯色的比例 > 50% ，呈現棕黃色（+++）。以（ ++ ）（ +++ ）者為免疫組化陽性表達。

1.2.4 提取總蛋白，Western blot法檢測VEGF/MMP-2蛋白的表達 從上述收集的病例中正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織石蠟標本I-II期、III-IV期中各選取5例，用組織蛋白提取試劑對每一份病例的石蠟組織分別進行總蛋白的提取，測定蛋白濃度。Western blot具體步驟：配置分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，SDS-PAGE 80V電泳3h后轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶37℃封閉1h，一抗（1：500）4℃過夜，二抗（1：1000）37℃孵育1h，ECL法顯色，同時檢測actin（1：500）的表達作為內參。

1.2.5 統計學處理 使用SPSS11.0軟件系統，計數資料進行χ2檢驗或Fishers確切概率法檢驗，相關比較采用Spearman等級相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VEGF/MMP-2基因水平的表達情況

如表1所示，正常卵巢組織中VEGF/MMP-2基因表達分別為0.18±0.11和0.41±0.35。卵巢乳頭癌組織VEGF/MMP-2基因表達分別為0.69±0.24和1.21±0.65。在卵巢乳頭癌組織中VEGF/MMP-2基因表達明顯升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。并且隨著卵巢乳頭癌組織分期升高，VEGF/MMP-2基因表達也增加，差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.2 VEGF/MMP-2蛋白的表達情況

正常卵巢組織中VEGF/MMP-2蛋白表達陽性率分別是6.1%和4.1%，而在卵巢乳頭狀癌中VEGF/MMP-2蛋白表達陽性率分別是91.3%和86.3%。

與正常卵巢組織相比，卵巢乳頭狀癌中VEGF/ MMP-2蛋白表達量顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。在III-IV中VEGF/ MMP-2蛋白高于I-II級的表達（P<0.05）（見表2）。

P<0.05

2.3 Western blot法檢測VEGF/MMP-2蛋白的表達

情況

對比圖1正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織石蠟標本I-II期、III-IV期，可見VEGF/ MMP-2蛋白表達逐級升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

卵巢癌在女性生殖系統癌瘤中排名第三[8]，僅次于子宮頸癌和子宮體癌。近年，宮頸癌及宮體癌早期篩查技術的大力發展，對宮頸癌及宮體癌的防治已取得顯著成效，總生存率明顯升高。而卵巢癌的早期診斷非常困難[9-10]，發現時已有卵巢癌的浸潤、盆腹腔的轉移，因此成為死亡率最高的腫瘤。而腫瘤發生轉移和侵襲的兩個重要環節就是新生血管形成與細胞外基質金屬降解。

VEGF作為血管內皮特異性的有絲分裂原，對血管內皮細胞的增殖、血管滲透性增加等方面具有很強的調控作用[11-13]。因此VEGF在腫瘤細胞與血管內皮細胞都有陽性表達，只是在惡性細胞中，VEGF過度表達。從我們的研究發現，VEGF無論是基因水平還是蛋白水平表達量在正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織表達差異均非常明顯，尤其是在卵巢癌III-IV期表達量最高，這說明VEGF在卵巢乳頭狀癌轉移過程中發揮重要的作用。

MMP-2作為細胞外蛋白水解酶，主要功能是降解細胞外基質的多種成分。細胞外基質是阻礙癌組織學屏障，而癌細胞可以通過自身分泌或旁分泌等方式合成大量的MMP-2，破壞基底膜的完整性，發生侵襲和轉

移[14-15]。我們的實驗中可以觀察到MMP-2基因和蛋白的表達在正常卵巢組織、卵巢乳頭狀癌組織石蠟標本I-II期、III-IV期也逐漸升高，而MMP-2在III-IV期高表達，有利于卵巢癌細胞的浸潤和侵襲。

總之，VEGF通過增加血管通透性和促進血管形

成[16]，MMP-2通過裂解細胞外基質，加速了卵巢癌的惡性轉移[17]。因此研究VEGF/ MMP-2兩者的相關性為深入了解調控腫瘤微血管生成的分子機制及其與腫瘤侵襲和轉移關系奠定基礎。而VEGF/ MMP-2在III-IV期的高表達，成為設計和研制治療卵巢癌藥物的新思路。

參 考 文 獻

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