人乳脂中甘油三酯分析方法及組成的研究進展

韋 偉，張星河，金青哲，王興國(江南大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，江蘇 無錫 214122)

母乳是一種天然的功能性食品，母乳的營養十分豐富，為新生兒提供生命中前幾個月所需的全部營養物質，并且根據嬰兒的生長發育不斷地調整。母乳的組成復雜，目前研究者們發現母乳含有2 000多種物質，其中300多種是嬰兒生長發育必不可少的成分。母乳中的脂肪，也稱為人乳脂(HMF)，占母乳總量的3%～5%，是母乳中一種重要的組成成分。人乳脂是母乳中主要的能量來源，為嬰兒提供了約一半的能量，同時富含具有特殊生理功能的脂肪酸和復雜脂類，也是脂溶性維生素的載體。

甘油三酯(TAG)是人乳脂中含量最多的一類脂質，約占98%。由于甘油三酯含有較多的同分異構體，各種同分異構體之間結構類似、性質相近，對其定性、定量分析都有一定的難度。人乳脂中脂肪酸組成非常復雜，因此甘油三酯同分異構體更多，而且大多數組成含量不到1%，分離分析的難度高。以往的乳脂肪甘油三酯的分析方法多是通過總脂肪酸組成和sn-2位脂肪酸組成計算得到。近年來，基于新型的分離技術如超臨界流體色譜、檢測技術如多維質譜技術等的迅速應用，加速了人們對甘油三酯立體結構的認識。

研究人乳脂甘油三酯組成的目的在于了解其生理功能和應用于人乳替代脂的開發。人乳脂中甘油三酯組成的分析為適合于我國嬰幼兒的配方奶粉用油的研究奠定了基礎。甘油三酯的分析還可用于建立基于甘油三酯的油脂識別模型。本文結合本實驗室近期的研究工作和國內外相關研究進展進行綜述。

1 人乳脂中甘油三酯的分析方法

1.1 人乳脂中甘油三酯的提取

人乳脂含有98%～99%的甘油三酯，0.26%～0.80%的磷脂，0.25%～0.34%的固醇(主要是膽固醇)，微量的甘油一酯、甘油二酯、游離脂肪酸和其他脂類成分。人乳脂中的甘油三酯的分析需要首先提取甘油三酯。目前最高效簡便的方法是薄層色譜法(TLC)。通過TLC技術，采用硅膠G作為吸附劑，正己烷、乙醚和乙酸(或者甲酸)作為流動相可以實現甘油三酯的提取。

1.2 人乳脂中甘油三酯的分離

非水反相高效液相色譜(RP-HPLC)是測定人乳脂中甘油三酯最常用的液相方法。甘油三酯是弱極性化合物，難溶于水，有機溶劑可增加甘油三酯的溶解性，廣泛使用的有機溶劑的組合是丙酮和乙腈[1]。固定相最常用的是十八烷基鍵合的硅膠柱(C18或ODS)。RP-HPLC分析甘油三酯的出峰按照碳原子當量數的大小依次洗脫。

銀離子高效液相色譜是分離人乳脂中甘油三酯同分異構體的最有效的色譜方法[2]。甘油三酯根據其組成脂肪酸的不飽和程度不同而得到分離，甘油三酯分子中雙鍵數量越多，保留時間越長。甘油三酯分離先后順序是：SSS、SSM、SMM、SSD、MMM、SMD、MMD、SDD、SST、MDD、SMT、MMT、DDD、SDT、MDT、DDT、STT、MTT、DTT、TTT，其中S、M、D、T分別為飽和、單不飽和、含有兩個及三個雙鍵的脂肪酸。分離甘油三酯同分異構體的出峰先后順序為[1]：SMS、SSM、SMM、MSM、SDS、SSD、DSD、DDS、DMD、DDM。

高溫氣相色譜法分析甘油三酯穩定性高、準確性好,但只適用于脂肪酸飽和度較高的樣品[3]，不飽和度較高的甘油三酯可能會在高溫下氧化裂解[4]。甘油三酯的出峰順序按照其碳總數(CN)從小到大出峰[1]。目前主要采用非極性和中等極性兩種填料，前者能得到不同CN的甘油三酯，而后者可以具體到單個甘油三酯的種類。一種常用的WCOT柱(材料為熔融石英，具有甲基苯基硅氧烷聚合物的涂層，25 m×0.25 mm)分離甘油三酯的出峰先后順序為：SSS、SSM、SSD、MMM、SDM、MMD、SDD、MDD、DDD、DDT。

超臨界流體色譜(SFC)是氣相色譜和高效液相色譜的重要補充技術，流動相是液化氣體(通常是CO2)[5]。SFC使用與GC類似的色譜柱，如果添加改性劑可以實現更好的分辨率，將甘油三酯同分異構體進行分離和鑒定。甘油三酯的出峰先后順序為：SMD、MMM、SDD、MMD、MMT、MDD、DDD、MDT、MTT、DDT、DTT[6]。

1.3 人乳脂中甘油三酯的測定

蒸發光散射檢測器(ELSD)是一種通用型的質量檢測器。ELSD可以用有機溶劑進行梯度洗脫，因為有機溶劑蒸發，所以對于非水相、揮發性高的有機溶劑測定結果沒有基線漂移帶來的誤差。ELSD對于甘油三酯的靈敏度顯著高于紫外檢測器和折光檢測器，是目前測定人乳脂中甘油三酯最常用的檢測器。

質譜(MS)不僅具有常見檢測器的檢測功能，還同時具備化學結構解析功能，可以在無標準品的條件下，利用特征碎片離子即可進行分子結構分析。MS與其他色譜技術的聯用(如GC-MS，HPLC-MS)，大大提高了甘油三酯分析的靈敏度和準確度，為甘油三酯的分析提供了強大的技術支撐。目前，適用于甘油三酯分析的MS電離源主要有電噴霧源(ESI)、大氣壓化學電離源(APCI)、大氣壓光電離源(APPI)等。

ESI理論上并非最適用于甘油三酯分析,但由于甘油三酯的手性結構，sn-2位的脂肪酸較sn-1,3 位更難斷裂，因此可用于確定甘油三酯的結構[7-8]。APCI是分析甘油三酯的一種較為理想的技術手段[9]。APCI譜圖上，甘油三酯主要形成3種特征碎片離子：[M+H-RCOOH]+、[M+H-RCOO-R’CO]+和[RCO]+，可根據其[DAG]+碎片及豐度判斷TAG組成及脂肪酸的?；恢肹10]。APPI與APCI相似，適用于甘油三酯的分析。但APPI質譜圖中甘油三酯共有4種特征離子，即：[M+H]+、[M]+、[RCO]+和[RCO-H2O]+。其中較為特別的是[RCO-H2O]+，該離子碎片不會出現在甘油三酯相應的ESI質譜圖中，但這個信息對于甘油三酯鑒定卻十分有用[11]。

常用的其他質譜儀還有四極桿飛行時間質譜(Q-TOF/MS),可在寬質量范圍內實現高分辨、得到物質準確相對分子質量、能夠獲得真實的同位素峰形成分布，同時具有高靈敏度的串聯質譜功能[12]。該技術得到未知物的分子式，既可用于甘油三酯的定性與定量，也可用于脂質組學的研究。串聯質譜(MS/MS)可以有效地解決軟離子化技術(如ESI、MALDI等)造成的碎片離子信息不夠的問題，解決問題的方法是在這些軟離子碎片的基礎上串聯另外一個質譜[13]。串聯質譜能實現母離子和子離子的精確質量測定，是目前鑒定甘油三酯及同分異構體最有效的方法之一。

2 人乳脂中的甘油三酯組成

2.1 不同國家及地區人乳脂中甘油三酯的組成

Breckenridge等[14]采用GC配備氫火焰離子化檢測器(FID)測定人乳脂中甘油三酯組成。結果顯示，加拿大人乳脂中主要的甘油三酯類型為C52(39.0%)、C50(17.6%)、C54(16.4%)、C48(9.0%)和C46(5.5%)，甘油三酯?；荚訑底罡邽镃60，最小為C38。采用GC測定的人乳脂中甘油三酯主要為C52(約占40%)，但是其中具體的結構和含量不得而知。通常結合脂肪酸和甘油三酯碳骨架sn-2位脂肪酸含量，大致猜測甘油三酯的結構[15-16]。目前兩者結合的方法在結構甘油三酯(1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯等)合成上經常被使用[17]，主要是由于設備要求低，方法簡便，但是不能測定甘油三酯的具體結構和含量。

Morera等[18]利用HPLC-ELSD分析了西班牙47個不同哺乳時期的母乳中甘油三酯組成，共分離出30種甘油三酯[19]。結果顯示有些甘油三酯的含量范圍比較廣(OPO含量17.56%～42.44%，OPL含量9.24%～38.15%)，另外有一些甘油三酯(LaMO、CaPO、LaCaO、LaPCa、LaOL等)的含量受到不同因素的影響較小，可以考慮作為人乳脂的指紋識別。隨后又利用HPLC-ELSD測定了西班牙40個母乳成熟乳中的甘油三酯，并分析其組成與不同因素間的聯系。Zou等[20]在45個丹麥母乳中分離并鑒定22種甘油三酯，其中含量較高的甘油三酯是OPO(21.52%)、OPL(16.93%)、OPLa+MMO(10.39%)、PPL(7.15%)和MLaO+POCa(6.65%)。夏袁[21]測定了我國無錫309個母親在不同哺乳時期(每個時期103個樣品)的人乳脂甘油三酯組成，分離并鑒定出25種甘油三酯。結果表明，含量最高的甘油三酯為OPL(23.24%～28.34%)，其次是OPO(13.87%～19.47%)，除此之外，含量相對較高、平均含量大于5%的甘油三酯為OLL、PLL、MOL、POLa、PPO。

Haddad等[22]采用RP-HPLC配備二極管陣列檢測器和GC測定了8名意大利志愿者母親的成熟乳的甘油三酯，并用RP-HPLC串聯ESI-MS3對甘油三酯進行了鑒定。共鑒定出98種甘油三酯分子，其中含量較高的是OPO(13.587%)、PPO/MSO(9.790%)、LaPO/MMO/MPPo(8.078%)、MOO/PPL/MSL/PpoO(7.449%)、PLL/PoOL/POLn(7.067%)。Kim等[23]測定了美國母乳中甘油三酯的組成，利用高離析液相色譜法對甘油三酯進行分離，利用ESI-MS 對甘油三酯進行鑒定。結果顯示，含量最高的甘油三酯是PPO(11.00 mg/L)、OPL(10.14 mg/L)、OPO(9.87 mg/L)、SPL(9.87 mg/L)和SPO(6.66 mg/L)，共測定出21種甘油三酯。Ten-Doménech等[24]利用RP-HPLC 配備UV和ELSD兩種檢測器測定15個來自西班牙的不同哺乳時期的人乳脂甘油三酯，共鑒定出42種甘油三酯，兩種方法測定出的高含量的甘油三酯分別是OPO(20.3%、20.21%)、OPL(9.88%、10.1%)、LaPO/MMO(7.39%、7.30%)。

Tu等[25]采用SFC串聯Q-TOF-MS測定了我國54個不同區域(北京、湖北和四川)、不同泌乳時期的人乳脂中甘油三酯的組成，共分離鑒定64種甘油三酯。結果顯示，不同地區和泌乳時期的人乳脂中含量最高的甘油三酯都是OPL(10.09%～5.84%)，其次分別是OPP、OLO、SOL、OLL、SPO、OMM、OLL和OPLa。

Kallio等[26]采用UPLC-MS和UPLC-MS/MS測定了芬蘭和我國人乳脂中甘油三酯的組成，共鑒定300多種甘油三酯同分異構體。同時發現在芬蘭人乳脂中含量較高的甘油三酯分別是OPO(9.4%)、OPL(5.4%)、OPLa(3.5%)、OPS(3.2%)、OMO(3.2%)、OPP(3.0%)、OLaO(2.5%)和OOO(2.5%)。而我國人乳脂中含量較高的甘油三酯分別是OPL(10.3%)、OPO(7.1%)、LPL(4.5%)、LLO(3.3%)、OPS(2.4%)、LOO(2.4%)、OPP(2.4%)、LlaO(2.2%)和OPLa(2.1%)。同分異構體差異超過2%的甘油三酯在芬蘭人乳和我國人乳中分別占32.7%和36.7%。

2.2 不同泌乳時期母親的人乳脂中甘油三酯組成

研究表明人乳在分泌過程中會隨著嬰兒的生長發育的需要而發生改變，通常將嬰兒出生后1～5 d(或7 d)的母乳稱為初乳，出生后6～15 d的母乳稱為過渡乳，出生16 d及之后的母乳稱為成熟乳。

夏袁[21]發現我國無錫地區309個人乳脂樣品中，3個哺乳時期的人乳脂中甘油三酯組成有一定的區別，含量最高的甘油三酯為OPL，3個哺乳時期分別是28.34%、23.24%、24.92%，僅次于OPL的是OPO，含量分別是19.47%、14.05%、13.87%。Morera等[19]測定了不同哺乳時期的人乳脂中甘油三酯，發現每個哺乳時期人乳脂中甘油三酯呈現特定的組成，幾種甘油三酯在不同泌乳時期的人乳脂中顯著不同，含量最高的甘油三酯是OPO和OPL，在初乳、過渡乳和成熟乳中分別占到29.07%、20.11%，19.23%、14.97%和23.73%、18.8%。Tu等[25]發現，不同泌乳時期的人乳脂中甘油三酯組成有一定的區別，并且都與嬰兒配方奶粉中的甘油三酯組成有顯著的區別。

上述研究表明，3個哺乳時期的人乳脂不僅營養成分含量區別較大，構成也顯著不同，但是目前觀察到的變化沒有統一的規律。未來應該對不同哺乳期人乳脂中甘油三酯的變化規律及機制進行研究，用以指導不同階段嬰幼兒配方奶粉的生產。

2.3 母親飲食對人乳脂中甘油三酯組成的影響

近年來研究表明，人乳脂中甘油三酯組成的差異主要受母親飲食的影響。Linderborg等[27]用兩種方法(陰離子APCI-MS/MS和陽離子UPLC/ESI-MS/MS)分析了芬蘭西南部的不同飲食和體質指數母親的人乳脂中甘油三酯組成。結果顯示，母親的體重和飲食會影響甘油三酯的分布，但對甘油三酯的位置特異性的影響是相同的。食用推薦飲食的正常體重母親的人乳脂中含有更高含量的亞麻酸(Ln)和較少含量的硬脂酸(S)。無論是哪種人乳脂，其中含量最高的甘油三酯是OPO(約14.6%)。

夏袁[21]也發現我國無錫地區的志愿者母親的人乳脂中甘油三酯含量最高的是OPL，通過膳食調查與人乳脂組成比較發現飲食對于人乳中甘油三酯的組成有影響，不同于普遍報道中含量最高的OPO，無錫地區的母親可能因為食用較多的海產品(富含亞油酸)而在人乳中有較高的OPL。

3 結束語

甘油三酯是人乳脂中含量最高的脂質。通過對人乳脂中甘油三酯組成的總結，可以得到以下結論：①不考慮光學異構體，人乳脂中含有至少三四百種甘油三酯；②不同地區的人乳脂中甘油三酯有一定的差異，普遍報道中含量最高的甘油三酯是OPO，我國母親的人乳脂中含量較高的是OPL；③人乳脂中甘油三酯組成受到母親飲食的影響，不同哺乳時期的人乳脂中甘油三酯組成不同。

未來的研究方向包括如下幾個方面：①多維色譜技術和多維質譜技術。多維色譜可以對同分異構體達到很好的分離，但是受到流動相的影響，目前多維色譜應用在甘油三酯的研究多為離線二維色譜，開發新型的儀器設備或者色譜柱填充材料是研究方向之一?；谫|譜技術的脂質組學方法，尤其是多維質譜技術可以有效地鑒定更多甘油三酯的結構。②人乳脂中甘油三酯組成的大數據分析。搜集不同國家、地區、民族、飲食等的母親的母乳，分析其中甘油三酯的組成，研究不同國家、地區、民族等因素與人乳脂中甘油三酯的聯系，考察飲食、哺乳時期、身體狀況等因素對人乳脂中甘油三酯的影響，建立基于甘油三酯的指紋信息識別圖譜。③開發適合于我國寶寶的嬰幼兒配方奶粉用油。根據我國人乳脂的數據，開發適合我國寶寶“個性化”的營養需求的嬰幼兒配方奶粉用油也是未來的研究重點。

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