改良脊髓半橫斷損傷大鼠模型的建立及評價

孫德日，胡慧媛，朱悅

（中國醫科大學1.附屬第四醫院骨科，沈陽 110032；2.藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110122；3.附屬第一醫院骨科，沈陽 110001）

改良脊髓半橫斷損傷大鼠模型的建立及評價

孫德日1，胡慧媛2，朱悅3

（中國醫科大學1.附屬第四醫院骨科，沈陽 110032；2.藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110122；3.附屬第一醫院骨科，沈陽 110001）

目的 建立一種損傷更小、存活率更高、適用范圍更廣的改良的脊髓半橫斷損傷大鼠模型。方法 將20只雌性Sprague?Dawley大鼠隨機分為常規脊髓半橫斷模型組和改良脊髓半橫斷模型組，分別采用常規和改良的脊髓半橫斷法制備大鼠脊髓損傷模型，分別于術后1 d、3 d、1周和2周通過Basso?Beattie?Bresnahan（BBB）運動功能學評分評價大鼠后肢運動功能的恢復情況，并結合手術時間、術中出血量、術中脊髓后正中線定位以及二次手術顯露脊髓的成功率等主要參數，比較2組間的差異。結果 改良脊髓半橫斷模型組較常規脊髓半橫斷模型組手術時間更短，術中出血量明顯減少，BBB運動功能學評分更優，術中脊髓后正中線定位更準確，二次手術顯露脊髓的成功率更高。在改良的脊髓半橫斷模型基礎上，成功建立了脊髓瘢痕組織移植模型，成功率可達70%以上。結論 改良的脊髓半橫斷模型在手術時間、術中出血量、運動功能學評分、術中脊髓后正中線定位及二次手術顯露脊髓方面均表現出明顯優勢，更適用于脊髓損傷研究，尤其是非急性期脊髓損傷研究。

脊髓損傷；大鼠模型；改良

臨床上脊髓損傷后很難實現功能恢復，為闡明其具體的機制，實驗研究中常選擇動物作為主要研究對象。因此，選擇理想的動物模型是開展疾病研究的前提。理想的動物脊髓損傷模型應符合以下條件：臨床相似性高，可調控性強，操作簡單，可重復性好，死亡率低，并發癥少［1］。目前脊髓損傷研究［2?3］主要采用完全橫斷脊髓損傷模型、半橫斷脊髓損傷模型、重物砸擊脊髓損傷模型、化學損傷脊髓損傷模型以及缺血性損傷、壓迫損傷、鉗夾及火器傷等脊髓損傷動物模型，分別用來模擬不同條件下的脊髓損傷。不同損傷方法對脊髓造成的損傷程度有所不同，研究者可以根據研究目的選擇不同的模型制備方法［4?5］。上述動物模型的制備過程中多數需要咬除椎板，顯露脊髓，然后再分別進行不同的損傷處理［6］。而且主要是在制備脊髓損傷模型的同時給予干預措施，這并不符合臨床實際治療情況。臨床上多數病例很難有機會在脊髓損傷的同時進行治療，所以非急性期脊髓損傷的動物模型更接近臨床實際情況，因此具有重要意義。

本研究在常規的脊髓半橫斷模型基礎上進行了改良，建立了一種損傷更小、存活率更高、適用范圍更廣的改良的大鼠脊髓損傷模型。該模型在手術時間、術中出血量、Basso?Beattie?Bresnahan（BBB）運動功能學評分、術中脊髓后正中線定位及二次手術顯露脊髓成功率方面均表現出明顯的優勢，取得了較為滿意的結果。本研究建立的改良的大鼠脊髓損傷模型更適用于脊髓損傷研究，尤其是非急性期脊髓損傷研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及手術器材

清潔級健康成年雌性Sprague?Dawley大鼠，體質量200～250 g，由中國醫科大學實驗動物部提供。戊巴比妥鈉（美國Sigma公司），紅霉素軟膏（北京雙吉制藥），0.2%碘伏消毒液（遼寧衛華醫藥），生理氯化鈉溶液（青島仁華制藥）。高壓消毒鍋（MLS?3020，日本SANYO公司），解剖顯微鏡（上海光學儀器廠），顯微手術器械、普通手術器械、大鼠手術操作臺（上海手術器械廠）。

1.2 動物模型的建立及分組

將20只雌性Sprague?Dawley大鼠隨機分為2組，每組10只。常規脊髓半橫斷模型組：1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠俯臥位固定于手術操作臺。背部正中皮膚備皮、常規消毒，計數肋骨定位T8水平，以此為中心，在T7～9水平對應后正中線處做縱行直切口切開皮膚，在正中線沿棘突向兩側剝離肌肉至椎板外緣，暴露并咬除T8椎板，顯露脊髓，以脊髓后正中血管為標志，用11號手術刀片于大鼠T8水平橫斷右半側脊髓，出血明顯，徹底止血后，再次消毒，逐層縫合肌肉和皮膚，表面涂抹紅霉素軟膏預防感染。改良脊髓半橫斷模型組：麻醉、固定等步驟同常規脊髓半橫斷模型組。然后在T8～9水平對應后正中線處做縱行直切口切開皮膚，在正中線沿棘突向兩側剝離肌肉至椎板外緣，將T8棘突尖部剪除，保留棘突根部，可見T8～9間的黃韌帶，將其切斷，顯露深層脊髓，提起T8棘突根部，用25號注射器針頭將脊髓右側劃斷，重復3次，保證半橫斷損傷完全，其余操作同常規脊髓半橫斷模型組。待大鼠清醒后放回動物室單籠飼養。大鼠清醒后可自由進食、飲水。術后每日腹腔注射80萬單位青霉素鈉，連續3 d，預防感染。保持飼養環境適宜的溫度和濕度，保證籠具清潔及大鼠身體干燥，每日按壓膀胱輔助排尿3次，直至大鼠恢復自主排尿反射。

上述2組大鼠在初次術后2周時，行二次手術顯露脊髓損傷區域。麻醉、固定步驟同初次手術，備皮、消毒后，取原手術切口切開皮膚，分離肌肉及瘢痕組織，術中認真止血，小心操作，顯露初次脊髓損傷區。常規脊髓半橫斷模型組大鼠二次顯露脊髓時，咬除T7和T9椎板，分別從近、遠端正常脊髓區逐漸小心向T8水平的脊髓損傷區分離，術中瘢痕出血特別明顯，有些需要終止操作，部分大鼠因術中出血死亡。改良脊髓半橫斷模型組大鼠在顯露脊髓時，在咬除T8和T9椎板后，小心分離瘢痕組織，較容易顯露脊髓損傷區，而且出血也明顯減少。顯露脊髓損傷區后，再次消毒，逐層縫合肌肉、皮膚。待大鼠清醒后放回動物室單籠飼養。

1.3 評定方法

主要包括手術相關指標評定和大鼠脊髓損傷后的運動功能評價。

1.3.1 手術相關指標評定：為比較2種大鼠脊髓損傷模型建立方法的優缺點，分別從手術操作的難度、術中脊髓定位的準確性和二次顯露脊髓損傷區的成功率等方面對2種模型進行評價。具體方法為在制備脊髓損傷模型的手術過程中記錄手術持續時間、術中出血量、脊髓后正中線定位難易程度以及術后2周再次顯露脊髓損傷區時的手術成功率。

1.3.2 運動學功能評價：脊髓損傷動物模型建立后，還需要進行運動功能學評價，既可以對脊髓損傷模型的穩定性進行評價，也可以對干預因素的效果進行評估。目前常用的運動功能學評價方法有Tarlov法、BBB評分法、步態分析、斜板實驗、網格爬行等方法［7?8］。每種評價方法均有各自的優缺點，而且根據脊髓損傷的特點有著不同的適用范圍。本研究采用了相對敏感且可靠的BBB評分法，分別于術后1 d、3 d、1周和2周對2組大鼠進行運動功能學評分，從而評價2組大鼠后肢運動功能的恢復情況。評分采用雙盲法，由經過培訓的兩人分別獨立完成，每只動物的觀察時間為4 min。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計分析軟件對各組大鼠手術相關參數及運動功能學評分進行統計學分析。結果以x±s表示，2組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 改良脊髓半橫斷模型在手術操作方面具有優勢

首先，改良脊髓半橫斷模型組大鼠在手術顯露時間和出血量方面明顯少于常規脊髓半橫斷模型組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。見表1?？梢婏@露脊髓時，改良脊髓半橫斷模型組脊髓副損傷的概率較常規脊髓半橫斷模型組明顯降低。

其次，術中脊髓后正中線的定位，改良脊髓半橫斷模型組較常規脊髓半橫斷模型組更為簡單、準確。常規脊髓半橫斷模型組半橫斷脊髓前需將椎板咬除，然后顯露脊髓，以脊髓后方的正中血管為標志。然而術中顯示大鼠脊髓后正中血管的變異高達40%，因此，常規脊髓半橫斷模型組需要靠相距較遠的T7和T9上下位脊椎的棘突連線以輔助確定脊髓正中線的位置（圖1A）。改良脊髓半橫斷模型組術中將顯露脊髓的上位棘突（T8）尖部剪除，保留棘突根部，但并不咬除椎板，切除相鄰節段之間的黃韌帶即可清晰地看到脊髓后正中血管（圖1B），并且可以憑借更近的上下脊椎（T8、T9）棘突連線確定脊髓中部，進行脊髓半切。

表1 常規脊髓半橫斷模型與改良脊髓半橫斷模型手術操作相關指標比較Tab.1 Comparison of parameters related with the surgery between standard SCI and improved SCI groups

圖1 2組脊髓半橫斷模型術中脊髓及正中動脈顯露照片Fig.1 Photos of the exposed spinal cord and median artery during the surgery in two SCI groups

再次，改良脊髓半橫斷模型組大鼠在二次顯露脊髓損傷區時，明顯易于常規脊髓半橫斷模型組。常規脊髓半橫斷模型組因在模型制備時咬除了椎板，再次顯露脊髓時手術難度加大，并且暴露出的脊髓表面有明顯瘢痕粘連形成，且出血明顯。常規脊髓半橫斷模型組8只大鼠因大量出血放棄二次顯露脊髓，其中1只大鼠死亡，二次手術成功率僅為20%。改良脊髓半橫斷模型組在第1次顯露脊髓時保留了椎板，有利于二次手術的定位和操作。且二次顯露脊髓時，去除椎板后可見脊髓損傷處與周圍組織粘連較輕，出血較少（圖2），改良脊髓半橫斷模型組中僅有2只大鼠顯露脊髓失敗。改良脊髓半橫斷模型組大鼠二次顯露脊髓的成功率明顯高于常規脊髓半橫斷模型組（P＜0.05，表1）。

圖2 改良脊髓半橫斷手術組二次顯露脊髓術中照片Fig.2 Photo of the exposed spinal cord during the second sur?gery in improved SCI group

2.2 改良脊髓半橫斷模型大鼠在術后運動功能恢復方面具有優勢

常規脊髓半橫斷模型組和改良脊髓半橫斷模型組大鼠在脊髓損傷術后3 d內，運動功能均未恢復，BBB運動功能學評分均為零。術后1周時，改良脊髓半橫斷模型組大鼠BBB評分（3.85±0.46）略高于常規脊髓半橫斷模型組（3.20±0.42），但差異無統計學意義（P＞0.05）。術后2周時，改良脊髓半橫斷模型組大鼠BBB運動功能學評分（13.25±1.52）明顯高于常規脊髓半橫斷模型組大鼠（10.45±1.63），差異有統計學意義（P＜0.05）?？梢姼牧技顾璋霗M斷模型組大鼠在術后運動功能恢復方面具有優勢。

3 討論

脊髓損傷研究目前主要在動物體內進行，以期能夠模擬人類脊髓損傷時的演變過程，從而實現在動物模型中對脊髓損傷機制和治療措施進行更有針對性的研究，獲得有價值的第一手資料，用于指導臨床診治［9?10］。因此，建立理想的動物模型是研究脊髓損傷的基本條件。只有應用與臨床疾病相似的實驗動物模型，研究的結果才更具有參考意義和科學價值。本研究建立并評價了改良的大鼠脊髓半橫斷模型，研究發現，改良的脊髓半橫斷模型相對于常規脊髓半橫斷模型在手術操作和術后運動功能恢復方面均具有明顯的優勢，更適于脊髓損傷相關的實驗研究。

首先，改良脊髓半橫斷模型組大鼠損傷恢復更好。常規脊髓半橫斷大鼠模型具備與臨床上脊髓損傷相似的特點，被廣泛用作模擬對象進行實驗研究［11?12］。而改良的脊髓半橫斷模型是在常規脊髓半橫斷模型的基礎上進行手術細節的調整，對脊髓的損傷標準沒有改變。在模型制備術后對其功能變化進行連續觀察，并與常規脊髓半橫斷模型進行對比，二者在脊髓損傷后早期的功能表現上相似，改良脊髓半橫斷模型組與常規脊髓半橫斷模型組比較，術后1周內BBB運動功能學評分無明顯差異，均具備脊髓半橫斷損傷的典型表現。從BBB運動功能學評分來看，改良脊髓半橫斷模型組大鼠損傷恢復的速度較常規脊髓半橫斷模型組更快一些，而且每只大鼠BBB評分的分布更為集中，這說明改良脊髓半橫斷模型組大鼠手術副損傷較小，對脊髓非損傷區域干擾小，手術的穩定性更好。

其次，改良脊髓半橫斷模型的手術操作簡單、可重復性、可調控性強。改良脊髓半橫斷模型組的手術操作因為只需要剪除T8脊椎的棘突尖部，不需要咬除椎板，對脊柱和脊髓周圍的血管破壞小，出血量顯著減少，同時也減少了止血的操作時間，因此手術時間隨之大大縮短。此外，2種方法制備模型手術過程中均聯用棘突連線和脊髓后正中血管確定脊髓后正中線，顯露脊髓時，改良脊髓半橫斷模型組不需要咬除椎板，從而降低了手術操作的難度和脊髓副損傷的概率，能更好的保證手術操作的穩定和均衡，更利于研究評價。術中確定脊髓中線時，在脊髓后正中血管變異的時候，需要借助上下位棘突水平確定。常規脊髓半橫斷模型由于已經咬除椎板，脊柱穩定性減弱，上下位棘突距離又較遠，定位容易受到一定的影響。但是在改良脊髓半橫斷模型中，可以通過相鄰、更近的棘突連線確定脊髓中線，能夠更準確地定位脊髓后正中線，利于準確實施脊髓半橫斷損傷的操作。因而，改良脊髓半橫斷模型還具有操作簡單、可重復性和可調控性強等優勢。

再次，改良脊髓半橫斷模型的死亡率低，并發癥少。改良的脊髓半橫斷模型因手術時間縮短，術中出血量明顯減少，這樣可以降低對動物的打擊，使其能夠更快的恢復。這種優勢在僅進行脊髓半橫斷損傷時表現的還不明顯，但是對于需要二次顯露脊髓的手術，改良手術的優勢就充分體現出來。改良的手術方法并沒有去除椎板，隔斷了脊髓瘢痕組織與周圍其他軟組織的粘連，使得再次顯露脊髓更為容易。且二次手術術中不需要剝離過多的軟組織瘢痕，自然就減少了術中出血量，可更大限度地允許手術的實施，也能更加保證大鼠的術后成活率。同時因為改良脊髓半橫斷模型組的脊髓瘢痕組織很少與周圍軟組織粘連，更容易觀察脊髓損傷區的位置，這樣更有利于給予治療干預措施。

總之，改良的脊髓半橫斷模型，無論是在手術時間、術中出血量及術中脊髓中線定位，還是在術后運動功能學評分，尤其是二次顯露脊髓方面，均顯示出明顯的優勢。該模型更加適用于脊髓損傷的研究，尤其適用于非急性期脊髓損傷的治療研究。

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（編輯 陳 姜）

Establishment and Evaluation of Improved Hemisection Model of Spinal Cord Injury in Rats

SUN Deri1，HU Huiyuan2，ZHU Yue3
（1.Department of Orthopedics，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110032，China；2.Department of Pharmaceutical Toxicology，School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110122，China；3.Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To establish an improved hemisection model of spinal cord injury（SCI）in rats with less severe injury and increased sur?vival rate.Methods Female Sprague?Dawley rats（n=20）were randomly divided into 2 groups：standard and improved hemisection model of SCI.Basso?Beattie?Bresnahan（BBB）scores were carried out to determine the hindlimb locomotor function at 1 d，3 d，1 week and 2 weeks post SCI，respectively.In addition，duration of operation，blood loss，location of posterior midline，and success rate of spinal cord exposure during the second surgery were used as the main parameters to evaluate the significance of the new model.Results Compared with the standard hemisection model，the improved hemisection model of SCI exhibited shorter duration of operation，less blood loss，higher BBB score，more accurate location of posterior midline，and higher success rate of spinal cord exposure during the second surgery.Based on the improved hemisection model of SCI，transplantation model of scar tissue in spine cord was then successfully constructed with a success rate above 70%.Conclusion The improved hemisection model of SCI shows significant advantages in many aspects related to the operation，which is applicable to the study of SCI，especially the non?acute SCI.

spinal cord injury；rat models；modification

R683.2

A

0258-4646（2017）03-0223-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.03.008

遼寧省自然科學基金（2013021032）

孫德日（1978-），男，主治醫師，碩士.

朱悅，E-mail：Zhuyuedr@163.com

2016-11-11

網絡出版時間：