山羊PMEL基因生物信息學分析

李麗莎??+李祥龍??+毛艷朋

摘要：基于生物基因組學數據庫，對山羊PMEL基因進行生物信息學分析，為研究該基因的功能提供依據。根據GenBank中山羊PMEL基因編碼蛋白序列（GenBank登錄號：XP_005680442.1），利用ExPASy數據庫中的ProtParam、ProtScale程序分別預測理化性質、疏水性；利用CBS Prediction Servers數據庫中的SignalP、TMHMM、Protfun程序分別預測信號肽、跨膜區及其功能；利用Predict Protein、PSORT Ⅱ Prediction、Motif Scan軟件分別預測二級結構、亞細胞定位、功能位點，并對不同物種PMEL基因構建系統發育樹。結果表明：山羊PMEL基因共編碼685個氨基酸，屬可溶性不穩定蛋白，無信號肽，在接近肽鏈的C-端存在1個跨膜區；二級結構以無規卷曲為主，該蛋白主要在內質網中發揮運輸、結合、信號轉導作用；不同物種PMEL基因的系統進化情況與生物進化過程中的動物學分類相符。山羊PMEL基因編碼蛋白在生物進化中具有較強保守性，該基因結構和功能的分析為山羊PMEL基因遺傳特性的進一步研究奠定了基礎。

關鍵詞：PMEL；山羊；生物信息

中圖分類號： Q785；S826.9+2文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0047-04

前黑素小體蛋白（premelanosome protein，PMEL）別稱gp100、ME20、PMEL17、silver[1]，由Sliver基因編碼，只在皮膚黑色素細胞、眼色素層黑素細胞、視網膜色素上皮細胞中進行表達[2]。前黑素小體蛋白是一種黑色素瘤特異性糖蛋白，對黑素小體的發育具有重要作用，通過形成蛋白水解的纖維狀矩陣從而使黑色素沉積[3]。人類PMEL基因編碼蛋白是一種黑素細胞特異性糖蛋白[4-5]，該位點編碼PMEL17蛋白，與小鼠的silver基因同源，編碼的蛋白分子質量為70 ku，由668個氨基酸構成；此外，該基因還編碼gp100蛋白，這2種蛋白質通過基因交替剪接成2個競爭性3′接受位點而產生，由于催化活性的不同，這2個位點可產生2種蛋白質[6]。在色素細胞中，黑素小體是一種專門用于合成、儲存、轉運黑素的細胞器，作為哺乳動物和其他脊椎動物的色素沉著來源[7]。PMEL作為黑素小體的一種結構蛋白，參與黑素小體由Ⅰ期到Ⅱ期的發育，這對后期黑素小體的形成及黑色素的沉積尤為重要。動物的被毛顏色是重要的質量性狀和經濟性狀，PMEL基因是最優秀的稀釋基因家族成員，該基因在鼠[8]、馬[9]、牛[10]、貓[11]、雞[12]等家養動物中的突變已被報道，這些突變均能使動物形成銀色表型，并逐漸損傷動物的聽覺和視覺功能。隨著人們對自然風潮的崇尚，天然毛色羊絨和羊毛的選育、生產已有廣泛的市場基礎，但鮮有關于山羊PMEL基因結構和功能的相關研究。本研究在已有山羊PMEL基因編碼蛋白序列的基礎上，利用生物信息學方法對其理化性質、疏水性、信號肽、二級結構、亞細胞定位、功能位點及其功能進行預測，基于鄰接法對不同物種PMEL基因進行系統發育分析，為后期研究山羊PMEL基因結構和功能對其突變的影響提供依據。

1材料與方法

1.2方法

1.2.1山羊PMEL基因開放閱讀框的確定通過NCBI中的ORF finder確定山羊PMEL基因開放閱讀框。

1.2.2山羊PMEL基因編碼蛋白的生物信息學分析通過ExPASy數據庫（http：//www.expasy.org/）提供的ProtParam在線程序預測該基因編碼蛋白的氨基酸組成、等電點、正/負電荷殘基數、原子總數、摩爾消光系數、半衰期、不穩定指數、脂肪族氨基酸指數、總平均親水性等；通過ProtScale軟件預測疏水性。通過CBS Prediction Servers數據庫（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）提供的SignalP 4.1 Server在線程序判斷該基因編碼蛋白是否存在信號肽；通過TMHMM Server v.2.0軟件預測跨膜結構區域；通過Protfun 2.2 Server軟件預測該基因編碼蛋白的功能分類。通過Predict Protein軟件（https：//www.predictprotein.org/）預測蛋白質的二級結構。通過PSORT Ⅱ Prediction軟件（http：//psort.hgc.jp/form2.html）預測該蛋白在細胞內的具體存在位置。通過Motif Scan軟件（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）預測該基因的功能位點。

1.2.3不同物種PMEL基因的系統發育本研究通過Clustal W程序對16個物種PMEL基因編碼蛋白序列進行多重序列比對，并利用MrBayes軟件構建系統發育樹。其中，設置原雞為外群，核酸替代模型為GTR模型（Nst=6），每個位點的替換速率為Gamma（Rates=Gamma），并運行100 000代（Ngen=100 000），每100代保存1棵樹（Samplefreq=100），舍棄老化樣本（sump burnin=250）后再將剩余的樣本構建一致樹。

2結果與分析

2.1PMEL基因的開放閱讀框

利用NCBI中的ORF finder對山羊PMEL基因的開放閱讀框進行定位。起始密碼子位于第14個核苷酸，終止密碼子位于第2 071個核苷酸，共編碼685個氨基酸。

2.2PMEL基因的理化性質

利用ProtParam軟件分析山羊PMEL基因編碼蛋白的理化性質。由該蛋白的氨基酸組成（圖1）可知，山羊PMEL基因共編碼685個氨基酸，其中亮氨酸（Leu）含量最高，占全部氨基酸的10.5%。帶負電氨基酸（Asp+Glu）、帶正電氨基酸（Arg+Lys）殘基的數量分別為53、51個。分子式為C3232H5122N890O984S26，原子總數為10 254。所有半胱氨酸形成胱氨酸（cystines）時的消光系數為98 735 L/（mol·cm），對應的吸光度為1.352；所有半胱氨酸均不能形成胱氨酸時的消光系數為 97 860 L/（mol·cm），對應的吸光度為1.340。哺乳動物網織紅細胞的半衰期為30 h，不穩定指數為46.77，脂肪族氨基酸指數為84.38，親水性總平均值為-0.093。[FL）]

2.3PMEL基因的疏水性

利用ProtScale軟件分析山羊PMEL基因編碼蛋白的疏/親水性（圖2）。其中，第624位異亮氨酸（I）得分最高，為3389，表示該位點的疏水性最強；第66位精氨酸（R）得分最低，為-2.567，表示該位點的親水性最強。整條多肽鏈呈現為親水性，預測山羊PMEL基因編碼蛋白為可溶性蛋白。

2.4PMEL基因的信號肽

利用SignalP 4.1 Server軟件分析山羊PMEL基因編碼蛋白的信號肽（圖3）。結果顯示，C值（raw cleavage site score，原始剪切位點得分）、S值（signal peptide score，信號肽分數）、Y值（combined cleavage site score，被結合的剪切位點的分數）不符合1個典型信號肽（C、Y值趨向于+1；S值在切割位點之前高，而在切割位點之后降低）的標準，表明山羊PMEL基因不存在信號肽。

2.5PMEL基因的跨膜區

利用TMHMM Server v.2.0軟件分析山羊PMEL基因編碼蛋白的跨膜區（圖4）。結果顯示，存在1個跨膜區，即 618～637，表明山羊PMEL基因編碼蛋白為1個跨膜蛋白。

2.6PMEL基因蛋白的功能

通過Protfun 2.2 Server軟件預測山羊PMEL基因編碼蛋白的功能。結果顯示，該蛋白發揮運輸和結合、嘌呤和嘧啶、生物合成的輔酶因子、中央中間代謝功能的概率最高，分別為0736、0.542、0.135、0.113；在基因本體分類中發揮信號轉導、免疫應答作用的概率最高，分別為0.141、0.111。

2.7PMEL基因的二級結構

[JP3]通過Predict Protein軟件預測山羊PMEL基因編碼蛋白的二級結構。結果顯示，H（alpha-helix，α螺旋） ∶[KG-*3]E（beta-sheet，β折疊） ∶[KG-*3]L（random coil，無規卷曲）=5.55% ∶[KG-*3]1927% ∶[KG-*3]7518%，

無規卷曲在整個二級結構中的比例較大，使蛋白質構象呈現出多樣性的特性。

2.8PMEL基因的亞細胞定位

通過PSORT Ⅱ Prediction軟件預測山羊PMEL基因編碼蛋白的亞細胞定位。結果顯示，該蛋白存在于內質網、線粒體、細胞質膜的概率最高，分別為34.8%、26.1%、17.4%。

2.9PMEL基因的功能位點

通過Motif Scan軟件預測山羊PMEL基因編碼蛋白的功能位點。結果（圖5）顯示，多囊腎病區域（polycystic kidney disease domain，PKD）位于第290～330個氨基酸，蘇氨酸密集區域（threonine-rich region，THR-RICH）位于第347～451個氨基酸。[FL）]

2.10PMEL基因的系統發育分析

通過貝葉斯算法構建的系統發育樹（圖6）顯示，山羊與綿羊、家牛、野牛的親緣關系最近，與偶蹄目中單峰駝、羊駝的親緣關系也較近。食肉目中家貓與大熊貓的親緣關系最近，靈長目中黑猩猩、東非狒狒、人類、蘇門答臘猩猩的親緣關系最近，嚙齒目中小家鼠與褐家鼠的親緣關系最近。裸鼢鼠雖為嚙齒動物，但與小家鼠和褐家鼠的親緣關系較遠，與其他哺乳動物的親緣關系也較遠。哺乳綱與鳥綱（原雞）之間的親緣關系最遠。上述不同物種間的親緣關系與生物進化過程中動物學分類相符合。[FL）]

3討論

前黑素小體蛋白作為一種黑素細胞特異性糖蛋白，直接參與黑素小體的生物合成，并在黑色素瘤和正常的黑色素細胞中高度表達[5]。免疫組化（immunocytochemistry）研究結果表明，在不同的毛發生長階段，黑素細胞表達的蛋白也有差異。當毛發進入生長期，毛球部的黑色細胞具有明顯的樹突狀結構，前黑素小體蛋白、酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白1均能表達，但在毛囊外根鞘的黑素細胞中只有前黑素小體蛋白可以表達[14]。對于前黑素小體蛋白的研究可為黑色素的集聚、黑素細胞的成熟分化提供重要依據。前黑素小體蛋白的突變主要發生在家養動物中，如Martnez等發現小鼠silv使其體內黑色素細胞丟失，導致毛色變為銀灰色[8]。Brunberg等發現，該蛋白的多態性與馬銀色毛色的形成具有極大相關性[9]。Menotti等發現，家貓SILVER位點的突變對黑色素的產物也有影響[11]。Schmutz等發現，PMEL的1個缺失和PMEL與MCIR之間的互作對能影響高原牛的毛色[15]。

利用生物信息學的方法對山羊PMEL基因編碼蛋白的氨基酸組成、疏/親水性、信號肽、跨膜區等一級結構、二級結構、功能位點、亞細胞定位進行預測。為使預測和分析結果具有可靠性，采用多種不同軟件，且預測分析軟件所用的原理和算法各不相同，預測和分析結果具有較高的可信度[16]。推算出山羊PMEL蛋白由685個氨基酸組成，其中亮氨酸含量最高，整條多肽鏈呈現為親水性，無信號肽。該基因編碼蛋白是一種跨膜蛋白，存在1個跨膜區，并包含1個PKD區和蘇氨酸富集區，這與Adema等、Maresh等對前黑素小體蛋白的研究結果[17-18]一致。已有研究表明，前黑素小體蛋白17包含1個RPT重復區域（proline/serine/threonine-rich repeat domain），該區域可決定體內黑素小體絲狀假足的形成，并影響黑色素的合成效率[13]。本研究預測出的山羊PMEL基因編碼蛋白的1個蘇氨酸富集區，可能對山羊絨（毛）的黑色素合成具有重要影響。山羊前黑素小體蛋白主要在內質網中發揮運輸、結合、信號轉導作用。該蛋白的二級結構組成中，無規卷曲所占比例較大，使蛋白質的構象呈現出多樣性的特性。利用貝葉斯算法對PMEL基因進行系統發育分析，發現山羊PMEL基因與綿羊、家牛、野牛的親緣關系最近，哺乳綱與鳥綱之間的親緣關系最遠，這不僅符合動物學分類，并反映了不同物種PMEL編碼蛋白結構上的穩定性對其生物學功能的重要意義。

4結論

山羊PMEL蛋白由685個氨基酸組成，是一種不穩定的可溶性蛋白，無信號肽，在接近肽鏈的C-端存在1個跨膜區。該蛋白主要在內質網中發揮運輸、結合、信號轉導作用。在二級結構中，無規卷曲所占比例較大，使蛋白質的構象呈現出多樣性的特性。系統發育分析表明，PMEL基因在生物進化過程中符合動物學分類，具有較高的保守性。

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