適合金銀花不同組織總RNA提取方法的篩選

易剛強??+蔡嘉洛??+朱貽霖??+張亞利??+劉峰??+劉湘丹??+高昱??+童巧珍??

摘要：對Trizol法、CTAB法、十二烷基磺酸鈉（SDS）法、多糖多酚試劑盒法、改良多糖多酚試劑盒法5種RNA提取方法提取金銀花葉片、莖、根、花蕾組織RNA的效果進行比較，以期獲得質量較好的金銀花不同器官的RNA，為后續分子生物學試驗奠定基礎。結果表明：改進后的多糖多酚試劑盒法能夠克服金銀花中RNA提取難度大的問題，能夠提取到質量、產量都很高的RNA，且穩定性好、無DNA污染，可以滿足進一步的半定量反轉錄PCR（RT-PCR）等試驗需要。

關鍵詞：金銀花；不同組織；總RNA；提取方法；改良多糖多酚試劑盒

中圖分類號： S184文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0063-03

金銀花（Floe Lonicerae）別稱忍冬花、銀花等，為忍冬科（Capfifoliaceae）忍冬屬（Lonicera）植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）以及同屬多種植物的干燥花蕾及其初開的花，具有清熱解毒、涼散風熱等功效[1]。當前，隨著人們消費水平的提高及對中藥材日益增長的需求，提高金銀花的綠原酸產量、品質已經具有重大意義。有研究表明，在金銀花綠原酸研究中，對控制綠原酸等活性物質相關酶基因在金銀花不同部位的表達模式進行分析極其重要；同時，反轉錄PCR（RT-PCR）、cDNA文庫構建等都需要高質量的RNA。目前，金銀花總RNA提取方法包括Trizol法、SDS法等[2-4]。本研究以金銀花根、莖、葉、花蕾為材料，通過對Trizol法、CTAB法、SDS、多糖多酚試劑盒法、改良多酚試劑盒法行比較，探索從富含多糖的金銀花組織中提取高質量、無DNA污染的RNA方法，以期為金銀花分子生物學研究及提高其活性成分含量研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試材料為金銀花的葉片、根、莖、花蕾。均取自湖南省隆回縣金銀花產業化種植基地（均由湖南中醫藥大學藥學院周日寶教授鑒定為正品）。

RNA提取過程中使用的槍頭、槍頭盒、離心管等塑料器皿均用0.1% DEPC水浸泡4 h后高壓蒸汽滅菌、烘干，研缽用75%乙醇潤洗消毒。試驗中所用提取液以及各種液態試劑均用0.1% DEPC水配制，于37 ℃放置過夜以抑制RNase活性。研缽、藥匙及玻璃器皿用鋁箔紙包好后于180 ℃烘箱中干熱滅菌6～8 h。

各種試劑配制參照《分子克隆實驗指南》進行。各種方法提取總RNA均定容為20 μL，重復試驗3次。

1.2RNA提取方法

每種材料均比較了CTAB法[5-6]、SDS法[7-8]、Trizol法[9]、多酚多糖試劑盒法、改良多酚多糖試劑盒法提取RNA的效果。

1.2.1改良CTAB法稱取0.2 g樣品，參照孟麗等CTAB法[10]并略加改進進行提?。ǜ倪M措施：①盡量采收幼嫩的植物組織作為提取DNA的材料；②將采集的樣品及時放入液氮中；③在DNA緩沖液中加入β-巰基乙醇的用量達2.5%～3.0%；④在提取獲得的DNA樣品中加入RNase）。

1.2.2Trizol法稱取0.2 g樣品，參照陳靜等的Trizol法[9]進行提取。

1.2.3SDS法稱取0.2 g樣品，參照王暑輝等SDS法[4]進行提取。

1.2.4多糖多酚試劑盒法稱取0.2 g樣品，按照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）說明書進行規范化操作。

1.2.5改良的多糖多酚試劑盒法稱取0.2 g樣品，按照浙江BioFlus多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書，在步驟3后添加等體積酚-三氯甲烷抽提這一步驟；同時，每步操作均在冰盒內進行；在最后的DEPC處理水定容階段，將原來的50 μL改為20 μL；其他過程同試劑盒說明書[11-12]。

1.2.6RNA完整性檢測分別取1 μL各器官的總RNA，在1.0%質量濃度的凝膠上分析RNA的完整性、質量。由于通常情況下，總RNA研究中的利用特點與要求，主要依據28S、18S rRNA凝膠電泳時所形成的譜帶特征。如果帶型清晰且亮度高，則表明所提取到的RNA樣品量大且質量高，而且以28S rRNA譜帶亮度高于18S rRNA更佳。同時，根據電泳結果還可以判斷RNA樣品中有無DNA、蛋白污染。

1.2.7總RNA純度、濃度測定分別取1 μL根、莖、葉、花蕾的總RNA，稀釋50倍后用核酸測定儀（Eppendorf，Biophotometer plus 6132），分別測量230、260、280 nm處的吸光度并計算D260 nm/D280 nm值、D260 nm/D230 nm值和RNA得率。

1.2.8半定量RT-PCR方法根據試驗中高通量測序中金銀花β-actin序列設計1對引物：β-actin-F：5′-AGGAACCACCGATCCAGACA-3′；β-actin-R：5′-GGTGCCCTGA GGTCCTGTT-3′。利用cDNA末端快速克?。╮apid-amplification of cDNA ends，RACE）合成金銀花[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]基因cDNA序列，設計目的基因RT-PCR反應引物：[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]-F：5′-ATGGGTCGAGGGAAGATTGAGA-3′；[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]-R：5′-TATGCCCATTTGACTCTCAGAG-3′。

以提取金銀花各器官的總RNA反轉錄的cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共25個循環；72 ℃ 10 min。

2結果與分析

2.1RNA純度及濃度測定

2.2RNA完整性分析

用改良CTAB法提取的金銀花根、莖、葉、花蕾總RNA，本研究只對花蕾、嫩葉片的RNA電泳圖進行分析，根、莖、電泳圖未列出。

分別取5 μL RNA樣品，在1.0%非變性瓊脂糖凝膠上進

行電泳檢測。圖1-a為SDS提取法電泳結果，可見RNA條帶明顯，但拖尾嚴重，且5S條帶較亮，說明RNA存在很大程度的降解；同時，可見樣品有較為嚴重的DNA污染。圖1-b為改良CTAB提取法電泳結果，圖中28S、18S條帶清晰，28S條帶的亮度約為18S條帶亮度的2倍，5S條帶隱約可見，未見DNA污染。圖1-c為Trizol法電泳結果，圖中未見RNA條帶。圖1-d為多糖多酚試劑盒法電泳結果，圖中28S、18S條帶清晰，28S條帶的亮度約為18S亮度的2倍，5S條帶隱約可見，但可見輕微DNA污染。圖1-e為改良的多糖多酚試劑盒法電泳結果，圖中28S、18S條帶清晰，28S條帶的亮度約為18S亮度的2倍，未見DNA污染。[FL）]

[FK（W+64mm][TPYGQ1.tif][FK）]

[FL（2K2]結合圖1、表1分析可知：SDS法、Trizol法提取的樣品，無法滿足后續試驗要求；改良CTAB法、多糖多酚試劑盒法、改良多糖多酚試劑盒法所提取的樣品純度高、完整性好，基本滿足后續試驗要求。

2.33種提取法提取各器官總RNA半定量RT-PCR檢測結果

根據筆者所在實驗室高通量測序及RACE技術得到金銀花基因設計引物，以改良CTAB法、多糖多酚試劑盒法、改良多糖多酚試劑盒法提取的金銀花根、莖、葉、花蕾總RNA為模板進行半定量RT-PCR（β-actin基因為內參基因）。由圖2可知，改良多糖多酚試劑盒提取法PCR擴增效果最佳，同時也表明[WTBX][STBX]AGL15[WTBZ][STBZ]基因在金銀花各部位中都有表達，在花蕾中表達量最高，在根、葉中的表達量次之，在莖中最低。與已有文獻報道的同源基因結果基本一致，說明改良多糖多酚試劑盒提取法提取的金銀花各器官的總RNA質量較好，可以進行半定量RT-PCR等后續分子生物學試驗。

3討論

大量研究表明，雖然植物RNA的提取方法有多種[13-15]，但是所獲得的RNA質量各有差異。由于不同植物組織成分的差異，其最適用的提取方法也不盡相同。特別是多酚、多糖含量高的植物材料，內源、外源RNA酶含量豐富。在完整的植物細胞內，這些物質與核酸是分離的；一旦細胞碎裂，即與RNA相互作用，影響高質量RNA的提取，導致各組織RNA提取過程中常出現產量低、質量差、易降解等問題，有時甚至不能用于相關研究。因此，RNA提取一直是影響金銀花分子生物學研究的難點，在RNA提取的整個過程中，除了保證環境的干凈、操作過程中不要引入雜質及細菌外，重點要除凈細胞里的多糖、多酚、蛋白質及DNA等雜質，并不要殘留提取過程中所加入的試劑。

從不同提取方法的試驗結果比較分析可知，Trizol法、SDS法不能提取樣品中的RNA，而廣泛應用于多糖多酚樣品的改良CTAB法能提取出效果較好的RNA；同時，使用有針對性的多糖多酚試劑盒則能提取出效果最好的RNA，證明金銀花樣品多糖多酚類成分含量很高。對于不同植物種類，體內積累的次生代謝產物不同，由于化學組分差異，沒有一種適合所有植物核酸的提取方法。因此，在進行植物樣品總RNA提取前，首先應了解樣品的性質，根據其所含相關次生代謝產物，選擇適合該樣品的有效提取方法，提取出高質量的RNA，以便繼續下一步的試驗操作。

本試驗中改良CTAB法能提取出質量較好的總RNA，且基本能滿足后續試驗的要求，但相對多糖多酚試劑盒、改良多糖多酚試劑盒法來說，效果較差。經過分析，可能存在以下幾個方面的原因：（1）CTAB法提取需要LiCl沉淀過夜，提取周期長，而多糖多酚試劑盒整個提取過程僅需要1.5 h即能完成，避免了長時間的放置，使RNA降解；（2）改良CTAB法提取所用的所有試劑（CTAB提取液、SSTE、LiCl等）均為筆者所在實驗室于使用前配置，需要嚴格滅菌；（3）改良CTAB法提取全程須在冰上操作，但反復的操作可能導致溫度不恒定。改良CTAB法提取RNA樣品過程中須嚴格控制低溫、快速、無污染這3點，以上因素即可能成為導致本試驗中改良CTAB法提取效果差于多糖多酚試劑盒的主要原因。

因此可見，以上5種提取方法中，SDS法提取的樣品不合格，Trizol法未見有RNA提出，改良CTAB法、多糖多酚試劑盒法、改良多糖多酚試劑盒法提取的金銀花總RNA樣品純度高、完整性好、降解少，基本都能滿足RT-PCR、分子克隆、高通量測序、實時定量PCR（q-PCR）等后續試驗要求，其中以改良的多糖多酚試劑盒法最佳，該方法能提取到高質量RNA。本研究結果為金銀花總RNA提取指明了方向。同時，高純度的RNA提取也為我們對金銀花綠原酸等活性成分合成關鍵酶基因的相關逆轉錄過程分析提供了保障，幫助我們了解金銀花中活性成分的合成機制，為進一步提高金銀花藥材中活性成分的積累打下基礎。

參考文獻：[1]《中華人民共和國藥典》委員會. 中華人民共和國藥典：一部[M]. 北京：化學工業出版社，2010：160.

[2]丁勇，范紅波，張高磊，等. 麻瘋樹種子總RNA提取方法研究[J]. 中南林業科技大學學報，2012，32（3）：158-161.

[3]楊元軍，王玉萍，翟紅，等. 甘薯塊根總RNA的高效快速提取方法[J]. 分子植物育種，2008，6（1）：193-196.

[4]王暑輝，徐倩，徐筱，等. 富含多糖多酚的側柏葉片總RNA提取方法[J]. 吉林農業大學學報，2012，34（1）：76-80，89.

[5]李志強，李瑩，陶建敏，等. 幾種果實不同組織總RNA提取及質量分析[J]. 果樹學報，2008，25（5）：764-768.

[6]周波，張旸，李玉花. 富含多糖草莓果實總RNA提取方法的改進[J]. 生物技術通訊，2004，15（1）：48-50.

[7]Symons G M，Davies C，Shavrukov Y，et al. Grapes on steroids. Brassinosteroids are involved in grape berry ripening[J]. Plant Physiology，2006，140（1）：150-158.

[8]Chang S，Puryear J，Cairney J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1993，11（2）：113-116.

[9]陳靜，高飛，周宜君，等. 改良Trizol法提取高質量蒙古沙冬青總RNA[J]. 生物技術通報，2013（10）：87-92.[ZK）]

[10]孟麗，周琳，張明姝，等. 一種有效的花瓣總RNA的提取方法[J]. 生物技術，2006，16（1）：38-40.

[11]魏琦琦，馮延芝，林青，等. 適于轉錄組測序的棗不同器官總RNA提取方法篩選[J]. 經濟林研究，2015，33（2）：63-67.

[12]龍洪旭，譚曉風，張琳，等. 油桐delta 8脫飽和酶基因的全長cDNA克隆及序列分析[J]. 中南林業科技大學學報：自然版，2015，35（7）：12-16.

[13]楊佳，吳詩杰，王淑萍，等. 發菜總RNA提取方法的比較與優化[J]. 江蘇農業科學，2015，43（9）：58-60.

[14]張濤，韓梅，劉翠晶，等. 人參總RNA提取方法厭捷轉錄酶的比較[J]. 江蘇農業科學，2015，43（8）：34-37.

[15]劉波，張曉明，郭巧生，等. 百蕊草根系總RNA提取方法比較及優化[J]. 江蘇農業科學，2015，43（1）：44-46.