玉米骨干親本及其衍生系中基因的序列變異及與株高等性狀的關聯分析

胡雅+潘亮+徐辰武

摘要：玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因是顯性矮化基因，由于其突變體在DELLA區的堿基缺失而使其呈組成型表達抑制GA響應，從而表現出植株矮小，種子發芽率低，葉片呈暗綠色等特性。對玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因在來源廣泛的96份玉米自交系中進行了目標序列重測序，并與株高和穗位高2個株型性狀以及穗長、穗粗、軸粗、穗質量、行粒數、穗行數和粒質量7個穗部性狀進行關聯分析。[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因在供試玉米自交系中共有66個變異位點，包括18個SNP和48個InDel。在編碼區發現24個變異位點，包括6個SNP和18個InDel位點。關聯分析發現，玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因中1個非同義突變位點與株高顯著關聯，另外1個非同義突變位點與穗長顯著關聯。

關鍵詞：玉米；骨干親本基因；株高；關聯分析

中圖分類號： S513.03文獻標志碼：

赤霉素是植物重要的生長調控因子[1]，其最主要的功能就是控制莖的伸長生長。大量矮稈基因的研究結果表明，株高與赤霉素生物合成和赤霉素信號轉導途徑相關。

GA信號傳導途徑中基因突變時，部分持續對GA響應的突變體表現為徒長，植株纖細并且葉片灰綠，這和施加過量GA的植株表型一樣；而無法對GA響應的突變體表現為葉片深綠、植株矮化、育性降低等，這與GA突變體合成受阻的表型相同，并且不可以通過外源施加GA得以恢復[2-3]。在植物體中，DELLA蛋白質是GA響應的最主要抑制因子，而GA傳導途徑的開啟主要是通過解除這種抑制作用得以實現。DELLA蛋白質在N端的DELLA結構域中有2個保守元件：DELLA和VHYNP，這2個元件的DELLA類蛋白能夠抑制對赤霉素的響應。本研究中的玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因，其3個突變體[WTBX][STBX]d8-1、d8-2023[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]d8-Mp1[WTBZ][STBZ]在DELLA區、VHYNP區且2個區域同時缺失氨基酸導致植株呈明顯矮化[4]。這些表明，[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因通過在GA轉導途徑抑制GA響應，來達到調控株高的目的。

玉米是世界三大糧食作物之一，也是集糧、飼、經“三元一體”的優勢作物。2003年我國科學家率先提出了農作物“骨干親本”的概念。此后，很多研究者利用分子標記技術，對玉米、小麥、大麥等作物的一些骨干親本進行了分析，認為深入研究并充分利用骨干親本有助于育種效率的顯著提高。在我國的玉米生產中骨干親本主要有黃早四、MO17、掖478、丹340、自330這5個骨干親本，在育種中發揮了很重要的作用[5]。此外，作物的株高與抗倒性、產量等性狀緊密相關，是重要農藝性狀之一。目前，矮稈作物在生產上已經顯示了巨大的增產潛力，矮稈基因的發掘及遺傳研究利用在育種中越來越受重視。在玉米中，已經有大量的矮稈突變體被發現，其中玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]是一種對外源GA響應并發生改變的矮化突變體。研究表明，玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]突變體是由于[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的DELLA結構域有堿基的缺失和突變，從而導致了矮稈的突變表型[6]。因此，[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因與株高的關聯分析研究十分重要。此前，Thornsberry等首次運用了基于候選基因關聯分析的方法研究了玉米的[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因，發現[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因中有9個多態性位點與玉米開花期的變化顯著相關[4]；Camus-Kulandaivelu 等選用不同的玉米自交系也得出相同結論[7]。Andersen等用另一玉米自交系群體試驗證明玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因序列多樣性與開花期和株高有關[8]。本研究選用來源廣泛的96份玉米自交系（包括5大骨干親本及其衍生系及糯玉米自交系）作為試驗對象，在對目標基因測序的基礎上，結合株高性狀的測定結果，利用候選基因的關聯分析方法，解析自然變異群體中[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的序列變異對株高等性狀的作用及其影響，從而篩選出一些重要的變異位點以及優異位點組合，為我國玉米骨干自交系優良基因的有效利用和玉米優質育種提供理論依據和技術支撐[9]。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究選取具有廣泛代表性的玉米自交系96份，包括我國溫帶玉米的5個雜種優勢群的代表性種質、熱帶/亞熱帶種質、糯玉米自交系和來源于國外的種質材料（表1）。供試材料于2014年夏季種植于青島基地，田間試驗采用完全隨機設計，重復2次。每個材料種植2行，每行10株，常規水肥田間管理。授粉20天后，每行選取5株，分別測量株高和穗位高。果穗收獲后晾干，考察穗部性狀，包括穗長、穗粗、軸粗、穗質量、行粒數、穗行數、穗粒數。

1.2DNA的提取和基因重測序

采用改良的CTAB 法[10]完成DNA提取。用分光光度計檢測DNA濃度，并以B73的[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因（GRMZM2G144744）序列為模板，在供試材料中采用NimbleGen[11]平臺技術進行目標基因區段序列捕獲并重測序?；虻哪繕诵蛄卸c捕獲和重測序委托華大基因有限公司完成。NimbleGen定點序列捕獲主要是利用雜交和DNA微陣列技術基因分離原理來捕獲目標區域，與目前被廣泛采用的基因組重測序技術相比，該方法具有高特異性和高覆蓋度、捕獲區域可按需設計和省時省力等優點。

1.3數據分析

2.3群體結構分析

為了解關聯作圖群體的遺傳結構，基于前期3 072個SNP分析自交系多樣性的數據，采用STRUCTURE軟件中基于數學模型的方法對96份自交系進行群體結構分析，將每個自交系細分到相應的亞群，通過分析比較發現，當K=3時，獲得了穩定的α值，基于模型的亞群，大都與自交系的系譜來源和系統聚類結果一致（圖1）。在自交系不是完全血緣純和的情況下，群體結構分析對關聯分析篩選特定準確等位變異位點起到了關鍵性的矯正作用。

2.4[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的連鎖不平衡

連鎖不平衡（LD）是不同基因座位上等位基因的非隨機組合現象。關聯分析是利用等位基因間LD的統計特性預測染色體某個區段與表型性狀的關聯程度。r2則是一種與等位頻率相關的度量參數，被用來衡量2個位點間的LD水平（圖2）。在[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的序列上分散分布著一些較強的LD結構?；騕WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]的多態性位點221、407和116、117、196、202，246和44、53、55，44和53、55，60和61、62，280和239，2 760 和66，816和813等之間均存在較強的連鎖不平衡結構（r2>0.9）；如圖3，對[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因分析區LD的衰退程度進行檢測，以位點距離和連鎖不平衡參數r2作散點圖，發現玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的連鎖不平衡隨距離的增加而快速衰減，在500 bp左右就衰退至0.1水平。

2.5[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因與表型的關聯分析

分別對株高、穗位高、穗長、穗粗、軸粗、穗質量、行粒數、穗行數和粒質量共9個玉米產量性狀進行測定，方差分析結果表明，這9個農藝性狀均在供試玉米自交系間存在極顯著差異（表4），這說明各性狀在不同自交系中具有較高的遺傳多樣性。利用變異系數表示每一性狀的絕對變異度，發現每一性狀均具有較高的變異度，但不同性狀的變異系數也存在較大差異。變異系數最高的為粒質量，達到45.22%，變異系數最低的為穗粗，僅為12.59%。

利用TASSEL3.0 軟件中的MLM模塊對株高性狀與[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因序列多態性位點進行關聯分析。在編碼區內共檢測到2個SNP位點與玉米株高存在顯著關聯（表5），這2個[CM（25]變異位點處于完全連鎖不平衡狀態，對株高的貢獻率為[CM）]

4.98%。這2個SNP中，SNP_2825為非同義突變，能引起蛋白質序列的改變，位于編碼區的 SNP_1525變異位點也為非同義突變，并與穗長有關，貢獻率為10.94%。此外，在啟動子區SNP_286和SNP_301也處于完全連鎖不平衡狀態，并與穗位高顯著關聯，貢獻率為8.18%。除株高，穗位高和穗長之外，本研究中所鑒定的其他農藝性狀不與[WTBX][STBX]Dwarf8基因序列變異存在顯著關聯。

3討論

豐富的變異是作物遺傳改良的基礎。作物種質材料的變異包括表型特征的變異和遺傳基礎的變異。豐富的表型變異和核苷酸多樣性也是通過連鎖和關聯分析進行遺傳作圖的重要基礎[20]。本研究中的供試群體在表型性狀上存在明顯的差異，估計這些性狀大部分是由遺傳基礎起到主要作用。對目的基因進行核苷酸多態性分析，并進而通過遺傳轉化等途徑，為在分子水平上有目的的進行作物遺傳改良創造條件。SNP和InDel是基因核苷酸變異中最常見的，往往能引起表型的變異。這其中SNP是基因組中發生頻率最高、數量最多而且密度最大的變異。本研究中，我們對[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因進行了序列變異分析，結果發現在該基因位點上存在著豐富的變異。與非編區相比，編碼區的核苷酸變異頻率較低，主要是受到更多選擇壓力引起的，這種趨勢在其他許多基因的核苷酸變異研究中得到證實。Ching等對36個玉米自交系的18個基因進行了研究，發現每41 bp會有1個多態性位點，每47.7 bp處會有1個SNP，85 bp處會有1個InDel[21]。相比較而言，本研究中的SNP和InDel頻率都偏低，造成上述基因間變異頻率差異的主要原因是人工選擇、自然選擇以及遺傳漂變等。

玉米產量的形成是一個復雜的過程，受多個基因及基因網絡的調控，也受到各個性狀的影響。株高作為一個重要的農藝性狀，對產量的作用有著深遠的影響[22-23]。育種家將半矮基因導入作物引發了谷物產量飛躍的“綠色革命”。但綠色革命在提高谷物產量的同時，也帶來了許多不利的影響，如肥料濫用使得土壤變得貧瘠，殺蟲劑的大面積推廣造成了空氣、水源和土壤污染，農民種植品種過于單一化導致遺傳多樣[JP3]性急劇降低。這些弊端嚴重影響了谷物的可持續發展，也使得運用新的品種改良理念和采取行之有效的舉措顯得更加重要。

矮稈玉米相對于高稈來說，有著不可比擬的優勢，有著更高的干物質轉化率，適宜密植，能實現高產，生產上具有巨大潛能。但矮源的遺傳多樣性低不利于玉米的產量和品質提高，大部分矮稈基因與某些不良性狀基因緊密連鎖，一因多效，使得這些基因的個體大多畸形，不便于繁殖利用。因此，創造或篩選新的矮源和矮稈基因對玉米育種和生產都具有重要的意義。本研究中在的目的基因[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]就是一個顯性矮化基因，由于其突變體在DELLA區的堿基缺失而使其呈組成型表達抑制GA響應，使得突變體植株表現出植株矮小。本研究中在對其進行序列分析的基礎上，進一步對其變異位點與[CM（25][KG*8]株高、穗位高、穗長等9個產量相關性狀進行了關聯分析，[CM）]

4結論

玉米基因的全長序列在96個常用玉米自交系中共發現了48個SNP和18個InDel。該基因編碼區含有6個SNP，可將96個自交系劃分成20種單倍型，玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因符合中性進化模型假設，沒有發生純化選擇，基于候選基因的關聯分析發現，該基因在編碼區的1個非同義突變與株高顯著關聯，另外1個非同義突變與穗長顯著關聯。研究結果表明，玉米[WTBX][STBX]Dwarf8[WTBZ][STBZ]基因的變異位點可用于分子標記輔助選擇改良現有種質，對中國玉米株型改良的分子設計育種具有一定的指導意義。

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