金花葵花總黃酮的精制工藝研究

陳亮??辛秀蘭??+蘇東海??+王曉杰??+胡仙妹??+李浡??+劉琦

摘要：通過靜態吸附解吸試驗從12種樹脂中優選出聚酰胺樹脂，其吸附率為38.20%、吸附量為43.93 mg/g，解吸率73.22%，綜合吸附解吸效率最高。聚酰胺樹脂動態吸附解吸試驗結果表明，在提取液上樣量50 mL、上樣液濃度4.37 mg/mL、上樣pH值6.0、上樣流速1.0 mL/min、水洗體積5倍、80%乙醇5倍體積洗脫、洗脫流速1.0 mL/min的最佳條件下，金花葵花總黃酮純度可達到72.6%，產品具有很大的開發潛力。

關鍵詞：金花葵；黃酮；聚酰胺樹脂；純化工藝

中圖分類號： R284.2文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0339-04

金花葵（Hibiseu smanihot L.）別稱菜芙蓉、野芙蓉、黏干、山榆皮，為一年生草本錦葵科秋葵屬植物[1]。

金花葵含有豐富的黃酮類化合物和Mn、Fe、Mg、Zn、Cu、Cr等微量元素，能顯著調節人體內分泌、免疫力，增強人體抵抗力，增強機體抗氧化能力，具有抗衰老、防癌、降血脂等功效。金花葵含有豐富的金絲桃苷[2]，對神經、循環、免疫、消化系統等具有調節活性，有抗炎、止咳，以及較強的抑制糖醛還原酶活性的作用，具有一定的抗抑郁功效。

金花葵適應性強，可廣泛種植，含有極為豐富的黃酮類化合物，是黃酮類化合物提取的較佳原料。但因其發現時間短，研究還不夠深入，其黃酮類化合物的提取分離方法還不夠完善，關于其生理活性方面的研究還不夠深入。

本試驗研究了12種樹脂對金花葵花總黃酮純化效果，通過靜態試驗從中篩選出純化效果最優的樹脂，并進行了動態試驗，得出樹脂純化就金花葵花總黃酮的最優工藝參數。

1材料與方法

1.1材料與儀器

金花葵由河南平頂山軍昊農業有限公司提供；HPD100、HPD400、HPD500、HPD722、HPD826、HPD100B、AB-8、S-8、X-5、D4020、聚酰胺、XDA-7PH型樹脂均為河北滄州寶恩化學有限公司生產；蕓香苷對照品（純度>98%）為江蘇南京蘇朗醫藥科技開發有限公司生產；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇均為分析純，由天津市津?；び邢薰旧a；其他試劑均為分析純。

AR2140型電子分析天平（奧豪斯國際貿易有限公司）；601超級恒溫水?。ńK省金壇市醫療儀器廠）；T6新世紀型分光光度計（普析通用科技有限公司）；TGL-16高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀離心機廠）；LABOROTA 4000旋轉蒸發儀（Heidolph公司）；LGJ-18B型冷凍干燥機（北京四環科學儀器廠有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1樹脂種類參照夏文寬等的研究[3-5]，選擇12種樹脂：HPD100、HPD400、HPD500、HPD722、HPD826、HPD100B、AB-8、S-8、X-5、D4020、聚酰胺、XDA-7PH型，各樹脂型號及物理參數見表1。

1.2.2樹脂預處理將樹脂分別置于95%乙醇溶液中浸泡12 h，用蒸餾水漂洗至無醇味，再依次用1%鹽酸、蒸餾水、5% NaOH溶液、蒸餾水洗至中性。

1.2.3總黃酮含量測定

1.2.3.1標準曲線的繪制參照Li的方法[6]，稱取 20.00 mg 蕓香苷標準品，加入75%乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中，制成濃度為0.20 mg/mL的標準溶液；分別吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL標準液置于25 mL比色管中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min。最后加10%氫氧化鈉溶液10.0 mL，搖勻，75%乙醇定容至25 mL刻度放置15 min，以相應試劑為空白，在505 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為y=4.780 7x+0.005 1，r2=0.999 6，在0.02～0.14 mg/mL范圍內有良好的線性關系。

1.2.3.2樣品的測定將金花葵提取物樣品置于25 mL比色管中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min。最后加10%氫氧化鈉溶液10.0 mL，搖勻，75%乙醇定容至刻度放置15 min，以相應試劑為空白，在505 nm波長處測定吸光度， 利用回歸

1.2.5動態吸附和動態解吸試驗

1.2.5.1動態上樣量的確定參考嚴志慧的方法[5]，將靜態試驗篩選出的樹脂裝于層析柱（1.0 cm×30 cm）內，用95%乙醇清洗滌至無白色渾濁，用蒸餾水洗至無醇味，將黃酮粗提液100 mL于柱頂注入，以1 mL/min的流速動態吸附，收集流出液，每5 mL為1個樣品，測定吸光度，計算黃酮濃度，繪制樹脂泄漏曲線，確定動態上樣量。

1.2.5.2水洗體積確定裝柱、進樣方法同“1.2.4.1”節，以1.0 mL/min的流速動態洗脫，分別使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍去離子水洗脫，收集洗脫液，每5 mL為1個樣品，測定其吸光度，計算洗脫液中黃酮濃度，確定最佳水洗體積量。

1.2.5.3醇洗體積確定裝柱、進樣方法同“1.2.4.1”節，以1.0 mL/min的流速進行動態洗脫，用去離子水、80%乙醇洗脫，收集洗脫液，每5 mL為1個樣品，測定其吸光度，計算黃酮濃度，繪制動態解吸曲線，得出最優乙醇洗脫體積。

1.2.5.4樹脂純化單因素試驗參考王克勤等的方法[8]，裝柱、進樣方法同“1.2.4.1”節。在其他因素不變的前提下，對單因素設定不同水平，以總黃酮吸附率為指標進行單因素試驗。單因素試驗設計如下：（1）上樣液濃度單因素試驗：在 1.0 mL/min 流速吸附、上樣pH值為 4.0、蒸餾水洗脫、80%乙醇1.0 mL/min流速洗脫的條件下，上樣濃度優選試驗設置為2.34、3.35、4.37、5.46、6.24 mg/mL。（2）上樣流速單因素試驗：在上樣濃度6.24 mg/mL、上樣pH值為4.0、蒸餾水洗脫、80%乙醇1.0 mL/min流速洗脫的條件下，上樣流速優選試驗設置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min。（3）上樣pH值單因素試驗：在上樣濃度6.24 mg/mL、1.0 mL/min流速吸附、蒸餾水洗脫、80%乙醇1.0 mL/min流速洗脫的條件下，上樣pH值優選試驗pH值設置為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0。（4）乙醇洗脫濃度單因素試驗：在上樣濃度6.24 mg/mL、上樣pH值為4.0、1.0 mL/min流速吸附、蒸餾水洗脫、1.0 mL/min 流速洗脫的條件下，乙醇洗脫濃度優選試驗設置為20%、40%、60%、80%、100%。

（5）洗脫流速單因素試驗：在上樣濃度6.24 mg/mL、1.0 mL/min 流速吸附、上樣pH值為4.0、蒸餾水洗脫、80%乙醇洗脫的條件下，洗脫流速優選試驗設置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min。

2結果與分析

2.1靜態試驗結果

2.1.1靜態吸附從表2可以看出，12種樹脂吸附量、吸附率大小順序為AB-8>聚酰胺>HPD826>HPD722>HPD100B>HPD100>D4020>HPD400>HPD500>X-5>S-8>XDA-7PH，其中AB-8的吸附率、吸附量最高，分別為38.81%和 44.63 mg/g，其次是聚酰胺，吸附率為38.20%，吸附量為 43.93 mg/g。

2.1.2靜態解吸由表3可知，12種樹脂解吸率大小順序為HPD500>HPD400>D4020>聚酰胺>HPD100>XDA-7PH>X-5>HPD826>HPD100B>S-8>HPD722>AB-8。[JP3]HPD500解吸率最大，為81.75%，其次是HPD400，解吸率為7954%，聚酰胺解吸率為73.22%，AB-8解吸率為45.65%。

2.1.3樹脂優選圖1表明，綜合吸附率和解吸率選擇聚酰胺樹脂作為純化金花葵花總黃酮樹脂。

2.2動態試驗

2.2.1上樣量的確定圖2表明，流出液中總黃酮濃度隨上樣量增加而增大，上樣量達50 mL（第10管）時，流出液中總黃酮濃度為 0.66 7 mg/mL，約為上樣濃度6.24 mg/mL的 1/10，即樹脂達飽和吸附[7]，故上樣量確定為50 mL。

2.2.4聚酰胺樹脂純化條件確定

2.2.4.1上樣濃度的確定圖5表明，上樣濃度在2.34～4.37 mg/mL 之間時吸附率隨上樣濃度的升高而增大，且上樣濃度為4.37 mg/mL時，吸附率達最大值22.92%，隨后吸附率下降，故確定上樣濃度為4.37 mg/mL。

2.2.4.2上樣流速的確定圖6表明，上樣流速0.5～1.0 mL/min 之間時，吸附率隨之增大，并于1.0 mL/min時吸附率達最大值，上樣流速繼續增大，則吸附率下降，故上樣流速確定為10 mL/min。

2.2.4.3上樣pH值的確定由圖7可以看出，上樣pH值為2.0～6.0之間時，吸附率隨pH值的增加而增大，且pH值為6.0時達到最大值，pH值繼續增大，則吸附率下降，故確定上樣pH值為6.0。

2.2.4.4乙醇洗脫濃度的確定由圖8可以看出，乙醇洗脫濃度在20%～80%之間時，洗脫液中總黃酮含量隨乙醇濃度的[CM（25]升高而增大，濃度為80%時達到最大值，乙醇洗脫濃度在[CM）]

80%～100%時總黃酮含量隨之降低，故確定乙醇洗脫濃度為80%。

2.2.4.5洗脫流速的確定由圖9可知，洗脫流速在0.5～1.0 mL/min 時，洗脫液中總黃酮含量隨流速的增加而增大，流速1.0 mL/min時達最大值36.07 mg/g，而洗脫流速在 1.0～2.5 mL/min時總黃酮含量逐漸降低，故洗脫流速確定為1.0 mL/min。

3討論與結論

金花葵花總黃酮經聚酰胺樹脂純化后具有一定的濃縮富集作用，粗提物純度為38.21%，聚酰胺樹脂純化后產品純度為72.6%，產品精制倍數為1.9倍，得到了良好的純化效果。

樹脂的極性是影響吸附性能的重要因素之一，極性不同吸附特點不同[9]。非極性樹脂是由偶極矩很小的單體聚合而成，與小分子疏水部分作用吸附有機物，適于吸附極性溶劑中的非極性物質，如芳香族化合物。中極性樹脂含酯基表面兼有疏水和親水2個部分，既可在極性溶劑中吸附非極性物質，又可在非極性溶劑中吸附極性物質。極性樹脂含酰胺基、氰基、酚羥基等，通過靜電相互作用吸附極性物質，如丙烯酰胺[10]。被吸附化合物的分子量大小和極性的強弱對吸附效果也有影響。例如同一種樹脂，對分子量較大的化合物吸附作用較強[11]。本研究選取的12種樹脂包含了極性（S-8、HPD826、HPD500）、弱極性（AB-8、聚酰胺、HPD722、XDA-7PH）、非極性（X-5、D4020、HPD100、HPD100B）和中極性（HPD400）4種類型，純化試驗結果表明，弱極性樹脂純化效果較好，其原因是金花葵花中的黃酮類化合物具有酚羥基和糖苷鍵，是弱極性的物質，根據相似相容原理，弱極性的聚酰胺樹脂較為理想，其酰胺鍵與黃酮類化合物的酚羥基相結合吸附效果優于其他樹脂。吳名全等采用聚酰胺純化乙醇回流提取金花葵花總黃酮，得到了較好的純化效果[12]。

影響樹脂吸附效果的主要因素為上樣液濃度、上樣液pH值、上樣流速及洗脫劑濃度、流速等。被吸附物濃度增加吸附效果增加，但被吸附物濃度增加有一定的限度，不能超過樹脂的吸附容量。若上樣濃度較低，部分樹脂未達到吸附飽和，而濃度過高時，黃酮提取液容易發生絮凝和沉淀，無法與樹脂充分接觸。在樹脂的吸附容量不是很大的情況下，一般低濃度下進行吸附效果較好[11]。陸志科等研究了大孔樹脂對竹葉黃酮的吸附分離特性，結果表明，上樣濃度為3.5 mg/mL時，大孔樹脂吸附率最高[13]。

黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，因而要達到高效的吸附效果，必須在弱酸性或酸性條件下進行吸附。pH值過大，金花葵花總黃酮中的酚羥基與聚酰胺以氫鍵的形式結合，堿性增大，酚羥基上的氫解離形成酸根離子，與樹脂結合力減弱，影響吸附率。肖坤福等采用PDH-600樹脂對多穗柯總黃酮的吸附性能研究，結果發現，pH值為5時吸附量最大，效果最好[14]。王冬梅等利用大孔吸附樹脂對翅果油樹葉中總黃酮進行了分離研究，翅果油樹葉樣液pH值為4時，LSA-10樹脂對總黃酮的吸附量最大[15]。

上樣流速主要是影響溶質向樹脂內表面擴散，決定吸附效果，如果吸附液流速太快，被吸附物質的分子未被樹脂充分吸附就提早發生泄露。劉錫建等利用X-5樹脂對沙棘中總黃酮進行精制研究，結果表明，吸附速度為2 mL/min效果最好[16]。任順成等研究AB-8樹脂對玉米須總黃酮的純化效果，結果表明，吸附速度為12 mL/min效果最理想[17]。

洗脫速度一般都較慢，因為流速過快，洗脫性能差，洗脫帶寬，且拖尾嚴重，洗脫不完全；而流速過慢，會延長時間[17]。因此，在洗脫時，一定要確定合適的洗脫速度，常用的解吸流速為0.5～3 mL/min[18]。

本試驗對所選用12種不同極性的樹脂進行靜態試驗，結合靜態吸附率和靜態解吸率選出聚酰胺是純化金花葵花總黃酮的最理想樹脂，因其含有酰胺鍵可與黃酮的酚羥基結合，使純化效果更佳。對聚酰胺樹脂動態試驗條件優化，確定了提取液上樣量50 mL、水洗體積5倍、醇洗體積5倍、上樣濃度4.37 mg/mL、上樣pH值6.0、上樣流速1.0 mL/min、80%乙醇溶液以1.0 mL/min流速洗脫的條件下，純化后的金花葵花總黃酮純度可達 72.6%。

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