基于離子選擇性微電極的黃瓜細胞內硝酸鹽測量

胡靜??毛罕平+胡圣堯??溫貽芳??于霜??+韓綠化+儲建華+高新浩

摘要：描述了能夠測量黃瓜葉片細胞內硝酸根離子活度和膜電位的雙管微電極的制作和使用情況。掃描電鏡顯示電極尖端不易受黃瓜表皮毛的損壞并通過微操縱器的步幅來控制電極進入細胞的程度。硝酸根電極的標定曲線顯示硝酸根離子選擇性微電極對硝酸根離子有很好的敏感性，數據可靠。用雙管電極測得的黃瓜葉片表皮細胞的硝酸根活度為165 mmol/L。結果證實之前用于大麥葉片的離子選擇性電極也能成功地用于黃瓜葉片，因此可以用微電極技術來診斷黃瓜營養。

關鍵詞：黃瓜；硝酸鹽；選擇性微電極；營養診斷

中圖分類號： TS207.7文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0373-03

在20世紀的最后幾十年，科技發達國家的溫室園藝呈現出創新和技術高速發展的特點。技術應用不僅僅在大范圍和高產量上，還主要在溫室產業的可持續性上?？沙掷m發展的焦點主要在產品的質量改進和對環境影響的大大減少上。但是在溫室園藝上經常會出現氮、磷、鉀、鈣的失調，氮是限制植物生長和產量的主要因子，氮也是作物中許多重要有機物如蛋白質、核酸、葉綠素、酶、維生素、生物堿和一些激素的主要成分。硝態氮是絕大多數植物的主要氮素來源，由于硝態氮重要的營養作用，因此細胞內硝態氮的測量就顯得尤為重要。微電極是一種能夠直接刺入植物細胞的微小探針，通常參考電極置于外部測量溶液中，測量電極既能置于植物表面也能直接刺入單個細胞，離子選擇性微電極能用于在體內估計細胞內的鉀離子[1-3]、硝酸根離子活度[4]和pH值[5-7]等。微電極技術能在體內測量細胞內的離子活度，然而絕大多數的測量在根部[8-9]，因為葉片是相對薄的，并且葉片表面特性更復雜，微電極用于葉片測量的植物主要有大麥和小白菜[10-13]。黃瓜是最常見的溫室作物，本研究制備了雙管硝酸鹽離子選擇性微電極，并用它第一次測量了黃瓜葉片的細胞內硝酸鹽濃度，以量化溫室作物的營養需求并建立精確的溫室管理模型。量化產品改進并減少環境污染是非常重要的。

1材料與方法

1.1植物材料

供試黃瓜品種為津優1號，在20～25 ℃下的濕紗布上對黃瓜種子催芽4 d后，把大小一致的苗移栽到盆里，盆的開口徑為22 cm，高度為20 cm，種植基質為珍珠巖。黃瓜苗生長在溫室里，保持濕度（70±10）%，用山崎配方種植黃瓜，黃瓜長至7葉1心時用微電極方法進行葉片測量。

1.2黃瓜葉片表面特性

黃瓜葉片（5 mm×6 mm）清洗后用4%戊二醛溶液固定，經過脫水處理后用單面刀片進行徒手切片，切成2 mm左右厚的橫斷面。將制備好的樣品粘在導電膠上，離子濺射鍍膜，噴[CM（25]金厚度為20[KG3]nm，然后將其粘貼在掃描電鏡樣品臺上，在[CM）]〖LM〗 15 kV 加速電壓下進行觀察、拍照。

1.3硝酸根離子敏感劑（nitrate sensor）的配制

用0.000 1 g的電子天平依次精確稱取0.006 0 g甲基-N，N，N-三十二烷基銨硝酸根離子（methyltride-docylammonium-nitrate，MTDDA-NO3-，Sigma公司生產），0.001 0 g溴化甲基-三苯基磷酸銨（methyltriph-enylphosphomium bromide，Fluca公司生產），0.065 0 g 2-硝基苯基-辛烷基乙醚（2-nitrophenyl octyl ether，Fluca公司生產），0.023 0 g聚乙烯（PVC，Fluca公司生產）和0.005 0 g硝化纖維素（nitrate celluclose），然后加入0.45 mL四氫呋喃溶解[14]。由于四氫呋喃會溶解塑料，配制硝酸根離子敏感劑所用的器械用具應避免使用塑料制品。配制好的硝酸根離子敏感劑應封存在玻璃容器中，第一次使用之前充分振蕩后再使用。

1.4雙阻微電極的制作

采用PMP-107型編程多管拉制儀，拉制微電極通過設置熱值水平（heat level）、加熱時間（time）和拉力（pull）使雙管玻璃管拉制成理想的微電極。所使用雙管玻璃管由管徑不同的2根單管玻璃管粘合而成，其內徑分別為0.800 mm和0.400 mm，外徑分別為1.000 mm和0.600 mm，粗管和細管中粘合有纖維絲，以使溶液能夠迅速地進入電極尖部，其直徑分別為0.100 mm、0.080 mm。根據我們的測定，理想的微電極針尖直徑為0.8～1 μm，加熱溫度過高，針尖過長或過軟都不適合插進葉片細胞中。

1.5雙孔硝酸根離子選擇性電極的制備及測量

在通風櫥中，將拉制好的雙孔玻璃管置于140 ℃下烘烤30～60 min，除去殘存在玻璃管內的水蒸氣和雜質，然后用 1 mL 注射器在雙孔玻璃管中粗管的尾部滴入1～2滴2%的二甲基二氯硅烷（DCMS，Fluca公司生產）進行硅化，使二甲基二氯硅烷的蒸氣進入玻璃管的尖部，目的是在粗管尖部形成一層疏水層，以利于硝酸根離子敏感膜的形成和作用。硅化后，在140 ℃下繼續烘烤1～1.5 h，使過量的二甲基二氯硅烷蒸發掉。然后，將已配制好的硝酸根離子敏感劑（nitrate sensor）灌入雙阻玻璃微管的粗管中，放入硅膠干燥的密閉容器中保存48 h以上以使多余的四氫呋喃蒸發。制備好的雙阻硝酸根離子選擇性微電極，用1 mL的注射器在雙孔玻璃管的細管中注入100 mmol/L KCl，用作測定膜電位，在粗管中注入100 mmol/L KCl和100 mmol/L KNO3的混合溶液，用于測定由于硝酸根離子敏感膜的存在使硝酸根離子跨膜運動而產生的膜電位[9]。細胞內測量由MultiClamp 700B 放大器和數模轉換器（Digidata 1322）獲得（Axon Instruments，USA），采樣頻率為10 Hz。pClamp 9.2（Axon Instruments）軟件用來采集和分析數據。

1.6硝酸鹽選擇微電極的標定

在使用雙阻離子選擇性微電極測定膜電位之前應該進行標定（表1）[14]，以確保：（1）硝酸根離子敏感劑對硝酸根離子的敏感性，來驗證硝酸根離子敏感劑配制質量的好壞。（2）硝酸根離子敏感劑對硝酸根離子敏感的程度，用經計算機軟件計算得到的3個參數（P1、P2、P3）來表示。P1為微電極參比電位；P2為電位差對-lg（aNO3-）作圖所得曲線的斜率，即標定溶液中硝酸根離子活度每改變1個數量級，所產生的電位的差值；P3為選擇性離子電極的檢出限濃度。理想的P2在48～58 mV之間，P3<1.0 mmol/L。P2大于58 mV，說明電極尖部被破壞；小于48 mV，微電極對硝酸根離子的敏感度不高，檢測限較高。在測定之后，也應該對微電極進行標定，以證實在測定過程中沒有破壞微電極的尖部和所充灌形成的[JP3]硝酸根離子敏感膜。測定前后所計算得到相近的P1、P2、P3才作為可靠的數據保留。測定之后將不能進行標定的電極棄掉。

1.8數據分析

計算硝酸根離子活度參數P1、P2、P3，用Sigmaplot繪圖軟件計算，根據公式E=P1-P2×[-lgaNO3- ]+P3[15]計算得到硝酸根離子活度。

2結果與分析

2.1葉片表面特性

從圖1-A上看表皮毛的間隔500～800 μm，電極尖端小于1 μm，因此只要足夠小心，表皮毛就不會破壞電極尖端，表皮細胞見圖1-B。表皮細胞的平均寬度是7 μm，在電極尖端碰到葉片時，電勢差會有一個劇烈的變化，微操縱器的單個步幅是0.2 μm或者0.04 μm，因此在電極尖端碰到葉片時，通過微操縱器的步幅來控制電極進入細胞的程度。

2.2微電極的標定

硝酸根離子選擇性電極在刺入植物葉片細胞前后都應該對微電極進行標定，以證實在測定過程中微電極的尖部和所充灌形成的硝酸根離子敏感膜沒有受到破壞。測定前后所計算得到相近的P1、P2、P3才作為可靠的數據保留，測定之后不能進行標定的電極及其數據放棄。

圖2所示為測定前后硝酸根電極的標定曲線。從圖2上可以看出，硝酸根離子選擇性電極的測定點電位及標定曲線在測定前后的重疊性都很高，測定前標定所得到的P1=-77.8 mV，P2=-54.0 mV，P3=0.000 122 1 mmol/L，測定后標定所得到的P1=-78.6 mV，P2=-53.3 mV，P3=0.000 148 4 mmol/L。 P1為微電極參比電位，本研究中所制備硝酸根離子選擇性電極的參比電位在-78 mV左右，P2為標定溶液中硝酸根離子活度每改變1個數量級，所產生的電位的差值。 理想的P2絕對值在48～58 mV之間，P2大于 58 mV，說明電極尖部被破壞；小于48 mV，說明微電極對硝酸根離子的敏感度不高，檢測限較高。本研究中所制備硝酸根離子選擇性電極的P2絕對值在53～ 54 mV之間，說明微電極對硝酸根離子的敏感度很好，滿足使用的要求。P3為選擇性離子電極的檢出限濃度，P3<1.0 mmol/L。本研究中所制備硝酸根離子選擇性電極的檢出限濃度在10-4 mmol/L量級，檢出限精度非常高。本研究標定前后3個參數值相近，說明硝酸根離子選擇性微電極對硝酸根離子有很好的敏感性，且在整個測定過程中一直保持良好的選擇性，沒有因為插入葉片而被影響。

2.3黃瓜葉片細胞內硝酸根離子活度的測定

當在其中一根玻璃管中灌入100 mmol/L的KCl，另一根玻璃管中灌入硝酸根離子敏感劑后，插入黃瓜葉片細胞內所得的膜電位和硝酸根離子的活度（圖3）。圖3-A表示記錄到的細胞內的膜電位-163 mV，圖3-B表示硝酸根離子選擇電極所記錄到的膜電位-198 mV，計算得到膜電位A與B之間的差值為-35 mV，應用 Simaplot 軟件模擬 Nicolsky-Eisenman 校正曲線和計算離子活度的方法，得到的細胞內硝酸根離子的活度，大約為165 mmol/L（圖3-C）。

3討論

本研究第一次報道了溫室內作物的離子選擇性微電極的細胞內記錄。離子選擇性微電極主要用在測量根上，很少有關于葉片的報道，主要原因是葉片很容易振動，很難穩定記錄。而且葉片表皮細胞的蠟質層也是很難刺穿的，電極很容易斷掉，但是只要優化電極的尖端和電極的形狀，以上這些困難就可以克服?？偠灾?，本研究證實了先前用于大麥葉片的離子選擇性微電極也能成功地測量黃瓜葉片，因此可以用微電極技術來診斷黃瓜的營養，這種技術也可能成為診斷作物營養的標準化技術。

參考文獻：

[1]MacRobbie E，Lettau J .Ion content and aperture in isolated guard cells of Commelina communis[J]. J Membr Biol，1980，53：199-205.

[2]Rona J P，Cornel D，Grignon C，et al. The electrical potential difference across the tonoplast of Acer pseudoplutanus cells[J]. Physiol Veg，1982，20：459-463.

[3]Maathuis F，Sanders D. Energization of potassium uptake in Arabidopsis thaliana[J]. Planta，1993，191：302-307.

[4]Miller A J，Zhen R G.Measurenent of intracellular nitrate concentrations in chura using nitrate-selective microelectrodes[J]. Planta，1991，184：47-52.

[5]Felle H H，Bertl A.The fabrication of H+-selective liquidmembrane microelectrodes for use in plant cells[J]. J Exp Bot，1986，37：1416-1428.

[6]Reid R J，Smith F A.Measurements of the cytoplasmic pH of Churu corullina using double-barrelled pH microelectrodes[J]. J Exp Bot，1988，39：1421-1432.

[7]Miller A J，Smith SJ.The mechanism of nitrate transport across the tonoplast of barley root cells[J].Planta，1992，187：554-557.

[8]Miller A J，Walker D J，Smith S J. Nitrate and potassium compartmentation in nitrogen and potassium starved barley root cells [M]. EU Commission Press，1995：263-268.

[9]Walker D J，Smith S J，Miller A J.Simultaneous measurement of intracellular pH and K+or NO-3 in barley root cells using triple-barreled，ion-selective microelectrodes[J]. Plant Physiology，1995，108：743-751.[ZK）]

[10]Walker D J，Leigh R A，Miller A J.Potassium homeostasis in vacuolate plant cells[J]. Proc Natl Acad. Sci，1996，93：10510-10514.

[11]Miller A J，Cookson S J，Smith S J，et al.The use of microelectrodes to investigate compartmentation and the transport of metabolized inorganic ions in plants[J].Journal of Experimental Botany，2001，52（359）：541-549.

[12]Cuin T A，Miller A J，Laurie S A，et al.Potassium activities in cell compartments of salt-grown barley leaves[J]. Journal of Experimental Botany，2003，54（383）：657-661.

[13]賈莉君，范曉榮，尹曉明，等. 雙阻離子選擇性微電極測定活體不結球小白菜葉片細胞中硝酸根離子的活度[J]. 土壤學報，2005，42（3）：447-452.

[14]Jia L J，Fan X R，Yin X M，et al. Measurement of nitrate activity in leaf cells of Chinese cabbage in vivo using doubled-barreled nitrate selective microelectrode[J].Acta Pedologica Sinica，2005，42（3）：447-452.

[15]Miller A J，Zhen R G. Measurement of intracellular nitrate concentrations in Chara using nitrate-selective microelectrodes[J]. Planta，1991，184：47-52.