傳統藏靈菇發酵乳揮發性風味特征研究

（北京工商大學北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京100048）

傳統藏靈菇發酵乳揮發性風味特征研究

郭婷，郝一江，張健，楊貞耐

（北京工商大學北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京100048）

采用固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）和氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）檢測了采集自西藏和新疆的6個藏靈菇樣品作為發酵劑制備的發酵乳的揮發性風味物質，共檢出揮發性風味化合物36種，其中有機酸12種，酮類4種，醇類8種，醛類1種，酯類4種，烯烴類1種，烷烴類2種，其他化合物4種。主成分分析顯示酸、醇類是Kef3、Kef2和Kef6發酵乳樣品的主要揮發性風味物質，乙酸和2-壬酮是Kef5樣品區別于其他樣品的特異性風味物質，Kef1樣品中的二叔丁基對甲酚、異戊醇和2-乙基己醇以及Kef4樣品中的苯甲酸、己酸乙酯和十四烷質量分數顯著高于其他樣品。樣品間的聚類和熱圖分析顯示，來源于新疆地區的3組樣品具有相似的揮發性風味物質種類和質量分數，各組樣品中質量分數較高、種類較多的揮發性有機酸和醇類化合物構成了傳統藏靈菇發酵乳獨有的特征風味。

藏靈菇發酵乳；揮發性風味物質；氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)；固相微萃取(SPME)

0 引言

藏靈菇是我國牧區常用的乳品發酵劑，其發酵乳具有調節血壓和血脂等多種保健功能，是潛在功能性乳品發酵劑來源[1]，工業生產性能受到了廣泛關注。

風味是評價乳品發酵劑生產性能的重要指標，是影響消費者選擇的首要因素[2]。發酵劑的選擇決定產品的風味特性，因此不同發酵乳風味特性一直是乳品研究的熱點[3]。目前普通酸奶發酵劑[4]、益生菌發酵劑[5,6]、嗜溫型發酵劑、嗜熱型發酵劑[7]和輔助發酵劑[8]的主要風味物質研究取得了較好的進展[9]，并初步揭示了主要菌株發酵乳風味物質形成的機制[10]。但對于藏靈菇發酵劑的風味特性報道較少，限制了該類發酵劑工業化生產的應用。

藏靈菇是酵母、乳酸菌、醋酸菌等形成的一個多樣的微生物共生體系[11]，其發酵乳具有獨特的酸味和香味[12]。本文研究藏靈菇發酵乳的風味特征及不同地區藏靈菇發酵乳風味間的差異，為明確傳統藏靈菇發酵乳的風味特征及其形成機理奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑

藏靈菇（Kef1、Kef2、Kef3采集于新疆牧區，Kef4、Kef5、Kef6采集于西藏牧區）；牛乳。

1.2 儀器與設備

電子天平（PL203），手動固相微萃取進樣器（DVB-CAR-PDMS），氣相色譜-質譜聯用儀。

1.3 藏靈菇發酵乳樣品的制備

取低溫保存的藏靈菇0.5 g接入質量分數為11%的250 mL經殺菌處理（115℃，15 min）的牛乳培養基中，置于25℃恒溫培養箱中靜置培養活化20 h后，用無菌生理鹽水將藏靈菇沖洗干凈，稱取0.25 g接種至200 mL已滅菌的牛乳中，25℃發酵20 h。

1.4 頂空固相微萃取發酵乳樣品

準確量取10 mL發酵乳樣品，加入1 g飽和NaC l溶液于萃取小瓶，放置于45℃水浴中并保持30 min,然后將已老化好的萃取頭插入到萃取瓶中進行萃取，富集風味物質30 min后取出纖維頭，然后將其插入GC-MS進樣口解吸5 min，拔出萃取頭進行GC-MS分析。

1.5 GC-MS分析

色譜柱：DB-WAX毛細管柱（30m×250μm，0.25 μm）；進樣口溫度為250℃。

升溫程序：初始溫度，40℃，保持2.5 min，以5℃/ min升溫到200℃，再以10℃/ min升溫到230℃，保持5 min。載氣(He)，恒定流速為3 mL/ min，進樣口溫度250℃，不分流。

質譜條件：電子轟擊（electron i mpact，EI）離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280℃，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃,質量掃描范圍30～400 m/z。

1.6 數據分析

揮發性成分分析：運用N IST14譜庫檢索，保留匹配度大于或等于800的成分；通過計算保留指數結合文獻保留指數進一步對化合物進行定性?；衔锒浚喊捶迕娣e歸一化法計算相對量。數據分析：每個樣品均設3次重復，數據以均值±方差表示，采用SPSS12.0軟件進行方差分析，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 藏靈菇發酵乳GC-MS檢測結果

6種藏靈菇發酵乳的揮發性風味化合物的分析結果如表1所示。共檢測出揮發性風味化合物36種，其中有機酸12種，酮類4種，醇類8種，醛類1種，酯類4種，烯烴類1種，烷烴類2種，其它化合物4種。Kef1發酵乳樣品含有20種揮發性化合物，其中有機酸9種，醇類5種，其質量分數分別占揮發性化合物總質量分數的36.52%和34.88%；Kef2發酵乳樣品含有34種揮發性風味化合物,其中有機酸12種，醇類8種，酮類4種，酯類4種，有機酸的質量分數（51.58%）高于Kef1樣品，醇類質量分數（27.22%）低于Kef1樣品；Kef3發酵乳樣品含有31種揮發性風味化合物,其中有機酸12種，醇類6種，酮類4種，酯類4種，以有機酸（59.17%）和醇類（24.46%）為主；Kef4發酵乳樣品含有27種揮發性風味化合物,其中有機酸9種，醇類6種，酮類2種，酯類4種，以有機酸（43.87%）為主,其酯類化合物質量分數（12.99%）高于其他樣品；Kef5發酵乳樣品含有30種揮發性風味化合物,其中有機酸10種，醇類8種，酮類4種，酯類3種，以有機酸（50.56%）和醇類（23.47%）為主；Kef6發酵乳樣品含有33種揮發性風味化合物,其中有機酸11種，醇類8種，酮類4種，酯類4種，質量分數最多的是有機酸（50.19%）。藏靈菇發酵乳改變了牛乳中所含酸、醇、酯等物質種類和質量分數，形成了復雜多樣的風味和滋味體系[13]。

（1）酸類化合物。揮發性有機酸主要由乳中脂肪在脂肪酶的作用下水解形成[14]，有顯著的特征氣味，是發酵乳清爽口感和乳香味的主要來源。本實驗檢測到藏靈菇發酵乳酸類物質質量分數為36.52%～60.19%，乙酸、丁酸、己酸和辛酸質量分數較高，后三者也是牛乳本底風味脂肪酸[15]，發酵后質量分數增加，這與葛武鵬等的酸奶檢測結果一致[16]。乙酸賦予發酵乳淡淡的酸味；丁酸具有多汁味、奶油味；己酸具有油脂味[14]；辛酸具有清香和微弱的水果酸氣味，淡酸味[17]。另外，這些脂肪酸還具有抗病毒、抗腫瘤、降膽固醇等生物活性，也是發酵乳中的重要功能組分[18]。

（2）醇類化合物。本研究檢測顯示各樣品中醇類的質量分數為5.37%～34.88%。乙醇由藏靈菇中的酵母無氧代謝產生，其它高分子醇類大部分來自脂肪氧化，由脂肪酶降解乳中的脂肪酸產生[19]。大分子醇類通常具有芳香、植物香、酸敗和土氣味，但閾值較高，對發酵乳整體風味的貢獻較小[20]。

（3）酮類化合物。發酵乳中酮類多為不飽和脂肪酸的氧化、熱降解和氨基酸降解產物[21]。樣品中酮類質量分數為3.43%～7.21%,該類化合物閾值低，可以賦予發酵乳典型的風味[22]。丁二酮被認為是酸奶風味形成的最主要部分。檢測顯示藏靈菇發酵乳中揮發性酮類化合物質量分數較少，共發現4種，比劉南南等[23]報道的酸奶中揮發性酮種類少。2-庚酮由亞油酸氧化產生，有奶油氣味，是酸奶風味物質中的主要成分；2-壬酮呈果香、甜香、青香及椰子、奶油的氣味；2-十一酮具有蠟香、脂肪香，并帶有奶油、乳酪的味道[14]。

（4）醛類化合物。醛類化合物的化學性質比較活潑，屬于不穩定的中間體化合物，在一定條件下易被還原成相應的醇，因此通常而言這類化合物在發酵乳中的質量分數都不高。盡管如此，由于這類化合物風味閾值較低，因而仍是酸奶風味中不可缺少的部分。本研究6個樣品中均檢出苯甲醛，質量分數在0.37%～ 3.99%。據報道苯甲醛具有苦杏仁、櫻桃及堅果香氣[14]。

（5）酯類化合物。本研究共檢出4種酯類化合物，質量分數在2.03%～12.99%。有3種乙酯類化合物，它們是由乙醇和牛乳中的脂肪酸反應產生。己酸乙酯具有強烈的甜的果香、菠蘿、香蕉香氣，有花香底調，擴散力強，香力持久性一般；葵酸乙酯具有近似于葡萄的香氣[14]。

（6）其他化合物。本實驗還檢測到少量的酚類和硫化物，二甲基二硫是牛奶中的本底風味物質，由β-乳球蛋白和脂肪球膜經光照后產生[24]。二叔丁基苯酚和二叔丁基對甲酚是食品抗氧化劑，在白酒的揮發性物質中有檢出，推測由酵母細胞自溶后釋放[25]。

表1 藏靈菇發酵乳揮發性風味物質

2.2 藏靈菇發酵乳揮發性風味物質的主成分分析

不同來源藏靈菇發酵乳的風味物質種類質量分數上均有較大差異。揮發性風味物質種類檢出最少的Kef1有20種，最多的Kef2有34種。質量分數差異最大的乙酸在樣品Kef6和Kef4中檢出量為0，而Kef5樣品中乙酸質量分數達30.43%。這使得不同來源藏靈菇的發酵乳表現出不同的風味趨向。為明確不同種類揮發性風味物質對藏靈菇發酵乳風味的影響，利用主成分分析法考察了揮發性風味物質與樣品間的分布關系，結果如圖1所示。

圖1 6種藏靈菇發酵乳和33種揮發性風味物質在第一和第二主成分上的分布散點圖

圖1中，f1和f2主成分的累計貢獻率為62.39%，風味物質中酸和醇對f1貢獻率分別為43.49%和19.33%，對f2貢獻率分別為32.33%和22.52%，另外酯、酮風味物質對f2貢獻率分別為11.94%和9.75%，醛風味物質對f1貢獻率為6.06%，其他風味物質貢獻率較低。樣品Kef2，Kef3和Kef6沿第一主成分（f1）正向（>0）分布，在主成分f2方向投影較短，這表明酸、醇類揮發性物質的種類和質量分數占有較大的比重，可能會對風味產生明顯影響。Kef5和Kef1分布在f1負方向，較為分散，Kef4是在f2主成分方向投影與其在f1主成分方向投影相接近的樣品，說明除了酸和醇類外，其它種類揮發性風味物質可能對其影響較大，具體如圖1所示，在Kef4射線附近分布的苯甲酸（9）、己酸乙酯（27）和十四烷（31）在Kef4樣品中的檢出量均顯著高于其它樣品（P<0.05）。類似的Kef5樣品中乙酸（1）和2-壬酮（22）質量分數，Kef1樣品中的二叔丁基苯酚（35）、異戊醇（14）和2-乙基己醇（17）的質量分數顯著高于其它樣品（P<0.05）。這些揮發性物質種類和質量分數間的差異造成了藏靈菇發酵乳樣品風味的不同。

2.3 藏靈菇發酵乳樣品的聚類分析

為了進一步明確不同來源藏靈菇發酵乳樣品間揮發性風味物質的定量性差異，實驗對6組樣品進行了聚類分析并繪制了樣品中揮發性物質質量分數的熱圖。由圖2可以看出，Kef1、Kef2、Kef3可以很好地聚為一類，而Kef4、Kef5、Kef6則各成一類，這說明通過風味成分的聚類分析，可以基本反映不同藏靈菇發酵乳樣品的風味特征。結果顯示來源于新疆地區的2組樣品Kef2和Kef3風味的種類和質量分數更為接近，這一類主要聚集了酸類和醇類化合物質量分數高，酮類、醛類、酯類質量分數較低的品種。采集自西藏的2組樣品Kef4、Kef5分類距離較近，酸類和醇類化合物質量分數較高，酮類、醛類、酯類質量分數次之，對藏靈菇發酵乳風味也具有一定貢獻。樣品Kef6與其它樣品間差異較大。由圖2可知藏靈菇發酵乳風味物質涵蓋了酸、醇、酮、醛、酯，其中質量分數較高的是酸類和醇類風味物質。

3 結論

采用固相微萃取、GC-MS和主成分分析法，對采集自西藏和新疆的6個藏靈菇樣品制備的發酵乳中的揮發性風味物質進行了分析。發現了36種揮發性風味物質，確定了主要的揮發性組分為酸類（36.52%～ 60.19%）、醇類（5.37%～34.88%）、酮類（3.43%～7.21%）、醛類（0.37%～3.99%）、酯類（2.03%～12.99%）及其他化合物。

圖2 樣品風味物質的熱圖和聚類分析

研究還發現，藏靈菇樣品間揮發性風味物質種類和質量分數存在較大差異，聚類分析的結果顯示來源于新疆地區的3組樣品間風味的種類和質量分數更為接近，采集自西藏的2組樣品分類距離較近，樣品Kef6與其它樣品間差異較大，產生差異的具體原因，需在明確藏靈菇微生物多樣性和豐度差異及其中微生物個體和群體間的風味物質代謝圖譜的基礎上進一步解析。

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Research on volatile flavor characteristicsof yogurt fer mented by traditional Kefir

GUO Ting,HAO Yijiang,ZHANG Jian,YANG Zhennai
(Beijing Advanced Innovation Cen ter for Food N u trition and H u man H ealth,Beijing Technology and Business Univisty, Beijing 100048,China)

Solid phase microextraction(SPME)and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)were used to analyze volatile com?pounds in fermented milk prepared by 6 Kefir samples collected fro mdifferent regionsof Tibet and Sinkiang.A total of 36 volatile flavor co mpoundsw ere identified in the 6 yogurt sa mples fermented by traditional Kefir,including 12 acids,4 ketones,8 alcohols,1 aldehyde,4 es?ters,1 olkens,2 hydrocarbonsand 4 other co mpounds.The resultsof principal co mponent analysis(PCA)show ed that organic acidsand alco?holsw ere themajor volatile co mponents in the sa mples Kef3、Kef2 and Kef6.For sa mple Kef5,acetic acid and 2-nonanone w ere the specific flavor co mpounds.The contentsof butylatedhydroxytoluene、3-methyl-1-butanol、2-ethyl-1-hexanol in Kef1 and benzoic acid、hexanoic acid,ethyl ester and tetradecane in Kef4 w ere significantly higher than other sa mples.The results of cluster analysis show ed that there were si milar contentsand kindsof compondsin the3 samples fro mSinkiang.In all these samples,the organic acidsand alcohol compoundsw ith rel?atively higher contentconstitute the unique flavor characteristicsof the traditionalKefir fermented milk.

yogurt fermented by traditional Kefir；volatile flavor components；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)；solid phase microextraction(SPME)

TS252.1

A

1001-2230（2017）01-0008-04

2016-06-23

郭婷(1992-)，女，碩士研究生，從事乳制品方面的研究。

楊貞耐