酶抑制法檢測蔬菜中農藥殘留存在的不足及提高檢測準確性的途徑

王艷樹++馬濤++王琴++魯文娟++湯新金++王文豐

摘要 酶抑制率比色法被廣泛應用于蔬菜農藥殘留檢測上，但是由于膽堿酯酶的特異性等因素使得該方法存在一些不足之處，使該方法的應用在一定程度上受到限制。分析了酶抑制法檢測蔬菜中農藥殘留存在的不足，并從嚴格儀器、試劑和試驗條件，改進前處理方法等方面提出提高檢測準確性的途徑，以期為酶抑制法的應用和推廣提供參考。

關鍵詞 酶抑制法；農藥殘留；準確性；不足；提高途徑

中圖分類號 TS207.5+3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）01-0104-02

農藥在農業生產中具有重要作用。從不使用農藥的自然農業發展到使用農藥的現代農業，農藥做出了積極的貢獻。但是隨著農藥在農業生產中的用量不斷加大和使用技術不規范等現象逐漸增多，其造成的環境污染以及農藥殘留問題越來越嚴重，威脅著人類的健康和安全?，F在，這一問題已經引起全社會的高度重視，甚至也形成了全球的關注焦點[1]。

目前，農藥殘留檢測的方法較多，受農藥品種繁多、化學結構和性質不同、樣品待測組分復雜等因素的影響，定性、定量分析農藥很有必要[2]。氣相色譜法、液相色譜法、薄層色譜法及質譜聯用等傳統的農藥分析方法只適用于實驗室檢測[3-4]，因為這些方法在預處理環節操作比較麻煩，還需要花費相當長的時間進行測試，不僅所需儀器的價格昂貴，而且運行成本也不低，最重要的是儀器要求一定的使用條件，同時對操作人員也有嚴格要求。近年來，關于農藥殘留快速檢測技術的研究較多，其中酶抑制比色法不僅研究最多，而且技術相對成熟，該技術的優點不僅體現在檢測速度快、成本低、操作簡單和便攜等方面，其在不需要配備昂貴的儀器、方便操作者掌握和推廣方面也占有絕對優勢[5-7]。酶抑制比色法可以有效緩解專業農藥殘留檢測機構嚴重不足的現狀，因為該技術非常適合現場檢測以及大批樣品的篩選，只需要將初篩中具有陽性反應結果的樣本帶回去進行實驗室驗證即可[8-9]。

酶抑制法具有諸多優點，如檢測速度快、成本低、效率高、操作簡單、便攜、對檢測人員技術水平要求低等。因此，酶抑制法在農業領域的應用日益廣泛，為了監控農藥殘留狀況，該技術在農業生產和銷售企業中被大量使用，這不僅有利于保障與提升農產品的質量安全水平，提高經濟效益[10-15]，而且可以大幅降低政府實施農產品質量安全監管成本，從而提高監管效率。酶抑制法在很多農產品生產基地、鄉鎮農技服務站被廣泛應用，因為其不僅可以在產地準出過程中實現對農產品中農藥殘留的快速、現場、實時檢測，而且在市場準入過程中也同樣能夠實現對農產品中農藥殘留的快速、現場、實時檢測。因此，酶抑制法已成為政府實施農藥殘留監管，實行蔬菜水果市場準入和退出制度的重要技術支撐。酶抑制法的推廣使用日益廣泛，其發揮的作用也越來越大，不僅體現在高毒農藥殘留監管的各個環節，而且滲透在打擊非法生產、濫用高毒農藥的工作中。

1 酶抑制法檢測農藥殘留存在的不足之處

20世紀60年代酶抑制法問世，80年代呈快速發展之勢，隨著研究的不斷深入，技術已相對成熟，逐漸成為目前研究最多的一種對部分農藥進行殘留快速檢測的技術[1]。但是該技術尚存在不足之處，即檢測對象不具有廣譜性，目前只適用于檢測某些樣品和農藥種類，如可以檢測蔬菜、水果中殘留的有機磷和氨基甲酸酯類農藥。另外，該方法還比較容易出現假陽性或假陰性現象[6]，這是因為其使用的酶、底物、顯色劑都具有一定的特異性，需要控制多個條件才能盡量降低影響。

1.1 檢測對象僅限于有機磷和氨基甲酸酯類農藥

酶抑制法的檢測機理是：在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農藥可以抑制膽堿酯酶正常功能的發揮，而且其抑制率隨著農藥濃度的升高而升高，因而判斷樣品中是否存在高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農藥只要參照抑制率即可得出結論[7]。

一般酶催化神經傳導代謝產物（乙酰膽堿）水解，乙酰膽堿與顯色劑發生反應，產生黃色物質，用分光光度計在412 nm處測定吸光度隨時間變化值，就能夠計算出抑制率。邱朝坤等以鯽魚腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶為檢測用酶，利用酶抑制法快速檢測5種蔬菜中有機磷農藥殘留情況。研究發現，要準確判斷農藥殘留情況，就要借助AChE酶活抑制率和農藥抑制方程。當AChE酶活抑制率>35%時，即可判斷該樣品中農藥殘留超標，該方法的回收率為80%～120%[8]。

此外，金盛燁等用酶抑制法測定有機磷和氨基甲酸酯類農藥含量的研究結果表明，酶活力的抑制率隨著農藥濃度的升高而升高。其中，呋喃丹檢測限為3.5 μg/L，對氧磷檢測限為12.0 μg/L，敵敵畏檢測限為25.0 μg/L，西維因檢測限為50.0 μg/L，含不同濃度呋喃丹的油菜汁的回收率為108.0%～118.0%[9-10]，大白菜汁的回收率為93.2%～107.0%。

酶抑制法在農殘檢測方面的應用越來越受到限制，一方面該方法只限于有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測，而且與國際和國內規定的殘留限量標準比較，檢測限很大比例都呈偏高態勢，陽性檢測結果還需要采用儀器法進行準確定性定量，因此由于該方法的檢測精度較低，不能夠成為法律仲裁依據[5，11]。另一方面，農藥品種更新較快，隨著新的農藥品種及用量不斷增加，越來越多的農藥品種在例行監測中的檢出率和超標率呈上升趨勢，從而被列入檢測范圍，如擬除蟲菊酯類、三唑類等其他類別的殺蟲、殺菌和除草劑。而酶抑制法對這些類別的農藥卻無法檢測出來[5]。

1.2 檢測精度不高，易受樣品性質影響

分析發現，現行的技術方法及標準獲得檢測結果主要通過判別樣品的顏色變化來確定，而判別顏色變化本身就成為阻礙檢測靈敏度提高的重要因素。同時，現行方法為了不干擾樣品組織液，待測樣品只能從樣品表面提取，對樣品組織內的殘留情況無法檢測，從而阻礙了樣品中農藥殘留的檢出限的提高[12]。

另外，酶抑制法容易產生假陽性現象的植物，不僅是《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測》（GB/T5009.199-2003）中提出的汁液中含有對酶有影響的植物次生物質的蔬菜，如蔥、蒜、韭菜、芹菜、香菜、蘿卜、茭白、蘑菇及番茄等，對于一些葉綠素、類胡蘿卜素等色素含量較高的蔬菜也難以準確檢測，使得該方法在以上這些蔬菜的主產區或生產基地上應用受到限制。

1.3 受儀器、試劑、試驗條件等因素的影響較大

一是速測產品質量良莠不齊。目前市場上的速測儀產品眾多，而且價格相差較大，一部分可能是偽劣產品。使用者在對有效產品進行質量判斷和選擇時，不僅沒有相關的認定和驗證程序進行檢驗，而且也沒有國家或行業的統一標準或鑒定規程進行參考[10，13]。目前儀器設備和試劑產業也缺乏監管和規范統一的行業標準，加上廠家的行業自律意識也比較淡薄，整個產業處于混亂狀態。這就造成了儀器設備和試劑市場的混亂，出現儀器性能不穩定、試劑性質差別較大等問題，導致同批次樣品的檢測結果的重現性不佳，對快速檢測結果的準確性和可信度產生嚴重影響。二是檢測試劑缺乏相關標準。酶抑制法的關鍵和核心是酶試劑，酶試劑的穩定性對檢測結果的影響很大。由于酶的穩定性對環境的變化非常敏感，一旦保存或使用不當都會使其失去活性，從而影響檢測結果的準確性。膽堿酯酶的制備來源廣泛，如家蠅、魚類、動物肝臟和血液以及小麥、大豆和玉米等材料，只需要將這些材料進行分離和純化即可獲得[14]。目前，各速測產品生產企業獲得酶試劑的途徑較多，有的通過市場直接購買，也有的利用自主分離、提取和純化等方法制備，還有的直接委托其他單位或企業幫助生產。在質量方面這些酶的差別較大，在活性和穩定性方面也同樣存在較大的差別，主要是由于酶的來源、類別、生產工藝等不同造成的。然而，目前對于我國最常用的AChE在活性、靈敏度和穩定性等性能方面缺少統一的測試和鑒定標準，這就造成市場上的酶試劑產品處于魚龍混雜、質量參差不齊的狀態。要想保證速測結果的準確性，僅僅依靠農藥殘留檢測用BChE 的標準（NY/T 1157—2006）是完全不夠的。三是缺少針對快速檢測前處理環節的設備和標準。目前國內對于快速檢測前處理環節的實際操作要求，主要參照國家標準《蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留量的快速檢測》（GB/T5009.199—2003）。但在實際操作中容易出現誤判現象，因為在實際處理時提取液的獲得途徑比較簡單，只是樣品在緩沖液中經過振蕩、混勻、靜置環節而已，這造成干擾物質去除困難，必須要經過凈化和富集過程才行。四是樣品上機前酶就已經開始與底物發生化學反應，致使△As較小，導致抑制率偏小或偏大，乙酰膽堿酯酶反應條件受環境等因素的影響較大，檢測的靈敏度和回收率還有待提高。

2 提高農殘快速檢測準確性的途徑

2.1 針對易出現假陽性及容易誤判的樣品

對于容易產生假陽性的樣品以及色素含量較高的樣品，檢測時可采用整體浸泡或沖洗的方法進行提取，取蔬菜的單體，用緩沖液浸泡或反復沖洗單體，盡量減少次生物質和過多的葉綠素對酶產生的干擾，從而可以提高檢測的準確性。

2.2 對有機磷和氨基甲酸酯類以外的農藥檢測

對除有機磷和氨基甲酸酯類以外類型農藥殘留的檢測，目前國標或行業標準中尚無快速檢測的方法，建議根據《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》（NY/T761—2008）等方法，使用氣相或液相進行檢測。

2.3 對因儀器誤差、化學試劑和操作方法不當等原因產生的問題

基于酶抑制率原理的農藥殘留快速檢測儀大多是在小型分光光度計的基礎上研制的，技術上比較成熟，但是生產水平良莠不齊，儀器的教研管理落后，沒有相關的驗證程序，所以質量技術監督部門應加強對農殘速測儀的認證和校驗管理。檢測單位在購買試劑時應盡量選用乙酰膽堿酯酶，因為相對其他酶類，乙酰膽堿酯酶與氨基甲酸酯類和有機磷類農藥的特異性反應最強，而且靈敏度高，基本不受干擾。要嚴格注意試劑的保存條件。為了避免樣品轉移的損失，減少各種人為因素的偶然誤差，相關研究單位應發展快速、經濟、環保和便捷的樣品前處理技術和自動化程度更高的速測儀器，以提高檢測準確性。

另外，檢測人員的素質相當重要，因為在取樣、提取、加酶試劑反應等操作中，檢測人員的操作在很大程度上會影響檢測結果。我國省市質檢機構檢測人員的素質和檢測水平較高，而基層速測人員由于工作開展較晚，其素質普遍較低，特別是區縣、大型農貿批發市場的速測人員，大部分未經過系統的樣品檢測分析知識培訓。因此，為了提高檢測人員的綜合素質，應對其加強技術和專業技能培訓，使其符合農殘速測工作的要求[15]。

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