B類Ⅱ型清道夫受體在牙齦卟啉單胞菌影響泡沫細胞形成中的作用

賀曉麗 梁冬雨 劉峰 陳建霞 羅禮君

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是一種炎癥性的疾病，單核細胞分化為巨噬細胞并攝入大量氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipid, ox- LDL)形成泡沫細胞是AS早期最主要的病理特征。相關的臨床研究均發現在動脈粥樣硬化斑塊中牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)的檢出率最高，幾乎達到100%，這就證明P.g與動脈粥樣硬化的發生、發展密切相關[1]。另外，各種研究也顯示P.g可能通過引起血小板的凝集、侵入動脈和心臟內皮細胞、促進巨噬細胞向泡沫細胞的形成、引發機體的免疫反應等方面加速和影響AS的發病進程[2-5]。但其確切機制尚有待進一步研究。

清道夫受體(scavenger receptors, SRs)是一類細胞表面糖蛋白,也是一種模式識別受體，主要分布于單核/巨噬細胞，具有轉運脂質的功能，在AS等脂代謝相關疾病中起著重要作用。SRs可以分為A、B、C、D、E、F、G七大類型，B類清道夫受體主要包括SR- BI、SR- BⅡ、CD36 3 個亞型，合稱CD36超家族。其中CD36與ox- LDL的識別、轉運、細胞內大量脂質的堆積等AS形成密切相關[6-8]。我們之前的研究證實[9]，P.g的炎癥刺激可以促進巨噬細胞CD36的表達，從而誘導加劇泡沫細胞形成。B類Ⅱ型清道夫受體(scavenger receptor class B type Ⅱ, SR- BⅡ, SR- B2)，又稱2型溶酶體整合膜蛋白(lysosomal integral membrane protein 2, LIMP2)，是一種溶酶體膜糖蛋白，在粗面內質網中合成，并且在溶酶體及內涵體等部位中大量存在[10-11]。本研究的目的是了解作為B類清道夫受體中的一員，SR- BⅡ在P.g誘導泡沫細胞形成過程中的變化、作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器 Lightcycler480熒光定量PCR儀(Roche,美國)，倒置相差顯微鏡(Nikon,日本)等。

1.1.2 主要試劑 C57/BL6野生型小鼠(同濟大學提供)，ox- LDL(上海啟晰生物科技有限公司)，牙齦卟啉單胞菌ATCC3327(上海交通大學醫學院口腔醫學研究所李鳴宇教授饋贈)，大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC25922(廣州環凱生物科技公司)，脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)來自大腸桿菌0111; B4、油紅O(Sigma,美國)；siRNA1、siRNA2(吉瑪基因)，siPORTTMNeoFXTM轉染試劑(Ambion,美國)，兔抗人LIMP2單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞獲取及培養 6～8 周的C57/BL6小鼠，腹腔注射2 ml濃度為40 ml/L的巰基乙酸，2 d后用PBS灌洗腹腔收集細胞。細胞計數后離心棄上清并重懸于含雙抗的RPMI 1640培養基中，將細胞接種到12孔板和24孔板，每孔細胞數量分別為1×106和5×104。置于CO2恒溫培養箱中培養。

1.2.2 細菌培養 將P.g凍存羊血接種于BHI血瓊脂平板，置于厭氧箱進行培養。待血平板上長滿黑色菌落后刮取部分置于BHI液體培養基中培養24～48 h，鏡下和生化鑒定其為純培養后，離心(5 000 r/min, 5 min)、棄上清，無菌PBS洗滌3 次后使菌液重懸，用比濁儀測定OD600的值。

1.3 泡沫細胞形成的檢測

24孔板中的細胞在加入ox- LDL(100 μg/ml)、P.g(moi=200)等各種刺激后置于培養箱中培養20 h，之后40 g/L甲醛固定30 min，沿側壁加入500 μl油紅O孵育10 min以后加入600 ml/L異丙醇并保持30 s～1 min，PBS洗滌3 次，倒置相差顯微鏡觀察泡沫細胞的形成并計算陽性比。

1.4 Western blot檢測泡沫細胞形成過程中蛋白含量的變化

12孔板中的細胞加入各刺激之后置于培養箱中培養，并分別在0、3、6、9、12、24 h時收集細胞蛋白并檢測蛋白含量。加入上樣緩沖液并煮樣，之后電泳、轉膜、牛奶封閉后加入LIMP2單克隆抗體(抗體濃度1∶100)4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜5 min×5 次后二抗室溫孵育2 h，充分洗膜后顯影觀察。使用Image J 1.43軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數字化，并與GAPDH灰度值進行比較分析。

1.5 Real- time PCR法檢測泡沫細胞形成過程中基因含量的變化

12孔板中的細胞加入刺激后在各時間點用Trizol收集細胞，提取細胞的總RNA后進行濃度測定并逆轉錄成cDNA，置于-20 ℃備用。設計基因的上下游引物序列如下：Gapdh- F(5'- TGACCACAGTCCATGCCATC- 3' )，Gapdh- R(5'- GACGGACACATTGGGGGTAG- 3' )，Limp2- F(5'- TGGACCACAGACACATGCAAT- 3' )，Limp2- R(5'- CGTTCTCAAAGCTGCTGAAAG- 3' )。

引物均由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。PCR反應體系為20 μl，反應條件為95 ℃30 s→95 ℃5 s→60 ℃34 s，持續40 個循環。反應結束后，根據內參基因Gapdh以及目的基因Limp2的Ct值計算出各樣本RNA的表達量。

1.6 siRNA干擾

設計合成的siRNA序列如下：Negative control:5'- UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT- 3' (正義鏈)，5'- ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT- 3' (反義鏈)；Mouse Limp2- 1:5'- CCA GAC GAU CGA GAA GAA UTT- 3' (正義鏈)，5'- AUU CUU CUC GAU CGU CUG GTT- 3' (反義鏈)；Mouse Limp2- 2:5'- GCU CCG GAA CAA GGC AAA UTT- 3' (正義鏈)，5'- AUU UGC CUU GUU CCG GAG CTT- 3' (反義鏈)。

在轉染試劑的作用下，將negative control、Limp2- 1、Limp2- 2、Limp2- 1+2(終濃度均為10 μmol/L)轉到12或24孔板中。轉染6～8 h后換成含雙抗的1640培養基，48 h后加入P.g刺激，8 h后收樣。24孔板用于油紅O染色。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 P.g促進泡沫細胞的形成

ox- LDL以及P.g刺激小鼠腹腔巨噬細胞，經過油紅O染色，可以觀察到空白組(NC)及P.g組沒有泡沫細胞的形成(圖 1)。只加入ox- LDL后，可以看到有少量泡沫細胞的形成，約占20%～30%，而共同加入P.g及ox- LDL后泡沫細胞約占60%～70%(圖 2)。結果表明P.g可以促進巨噬細胞的泡沫化進程。

2.2 P.g誘導SR- BⅡ表達的增加。

圖 1 油紅O染色顯示P.g促進泡沫細胞的生成

圖 2 4 組細胞中泡沫細胞陽性百分比

蛋白檢測結果顯示，只加入ox- LDL刺激后，SR- BⅡ蛋白的表達有所增加，在3 h左右開始上升、6 h達到峰值；只加入P.g刺激后，SR- BⅡ蛋白的表達量比只加入ox- LDL有明顯增加和延長；而同時加入P.g和ox- LDL刺激后，SR- BⅡ蛋白有較強的表達且明顯的延長(圖 3A)。Real- time PCR結果顯示，各組刺激后SR- BⅡ基因的表達水平與蛋白水平的表達趨勢基本一致(圖 3B)。結果表明，在泡沫細胞形成過程中，ox- LDL和P.g的刺激都可以促進SR- BⅡ的部分表達；但P.g的加入對SR- BⅡ表達有明顯的疊加效果。

圖 3 P.g誘導SR- BⅡ表達增加

比較P.g(moi=200)、E.coli(moi=10)、LPS(200 ng/ml)刺激小鼠腹腔巨噬細胞后SR- BⅡ的蛋白表達情況。結果示E.coli和LPS均未引起巨噬細胞中SR- BⅡ蛋白表達的明顯改變(圖 4)。表明P.g在泡沫細胞形成過程中促進SR- BⅡ蛋白的表達具有特異性。

2.3 SR- BⅡ參與調控P.g誘導的泡沫細胞形成

采用siRNA沉默SR- BⅡ的表達后，檢測相關刺激對泡沫細胞形成的影響。結果顯示，siRNA干擾之后SR- BⅡ蛋白的表達量明顯降低，且2 種siRNA合用的干擾效果最佳(圖 5A)。與正常對照組相比較，siRNA干擾后，無論是單純ox- LDL刺激，還是P.g+ox- LDL刺激誘導的泡沫細胞形成均明顯減少(圖 5B)。

圖 4 P.g誘導SR- BⅡ表達增加具有特異性

圖 5 SR- BⅡ表達沉默后泡沫細胞生成減少(*, P<0.05； #, P<0.05)

3 討 論

本研究發現P.g、ox- LDL共同刺激能明顯增加小鼠腹腔巨噬細胞泡沫化的形成。ox- LDL單獨誘導泡沫細胞形成過程中有SR- BⅡ的表達；單獨采用P.g刺激巨噬細胞，SR- BⅡ的表達有所增強；而在二者共同刺激下，SR- BⅡ的表達呈現出非常明顯的疊加效果。在進一步的實驗中，我們分別采用P.g、E.coli和LPS刺激巨噬細胞，發現P.g對SR- BⅡ表達的上調具有特異性。同時，干擾沉默SR- BⅡ的表達，也會影響到P.g促進的泡沫細胞形成。

既往研究表明，SR- BⅡ在對溶酶體蛋白的轉運、介導某些病毒及細菌的侵入及心肌肥厚等方面發揮作用，與進行性肌痙攣性癲癇、代謝病、心肌炎、手足口病等疾病有不同程度的關聯[12-14]，但尚未有文獻報道其在脂蛋白代謝及AS中的作用。Brown等[15]通過建立低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠模型研究P.g在加快動脈粥樣硬化進程中的作用及機制，研究結論是TLR2- CD36/ SR- B2依賴的通路會促進P.g介導的動脈粥樣硬化形成，但文中采用的抗體是針對CD36/ SR- B2的抗體，并非僅針對SR- BⅡ的特異性的研究。

心腦血管疾病是發展中國家的第一死亡原因[16]。AS是心腦血管疾病的主要病理基礎。目前公認[17-18]，長期反復的慢性炎癥是動脈粥樣硬化形成與擴展的一個重要原因。清道夫受體家族和P.g是動脈粥樣硬化形成的2 個關鍵要素。由于SR- BⅡ主要介導溶酶體對β- 葡糖腦苷脂酶的轉運，也是腸道病毒71型和柯薩奇病毒的受體，所以研究者更多關注其在代謝病、手足口病等疾病中的作用。最近的研究證實[19]，SR- BⅡ蛋白形成螺旋束結構負責與配體的結合(如β- 葡糖腦苷脂酶)，而根據同源性推斷，CD36，SR- BI也是通過相似的結構結合配體。這一發現為進一步深入研究SR- BⅡ在脂蛋白代謝中的作用奠定了基礎。我們的研究表明，SR- BⅡ在泡沫細胞形成中，尤其是牙齦卟啉單胞菌促進的泡沫細胞形成過程中發揮關鍵作用。這對未來進一步研究AS病理過程、了解P.g在AS過程中的致病機制有重要意義。