磷酸鈣復合材料構建模式對頜骨缺損修復效率的影響

李元 吳迪 王天玨 周宏志 胡開進

因炎癥、外傷、腫瘤等原因所致的牙槽骨、頜骨缺損可嚴重影響患者口腔功能及美觀，骨替代材料引導和誘導骨再生是骨缺損修復重建的研究熱點[1-2]。自固化磷酸鈣(calcium phosphate cement, CPC)可與水或水溶液調拌為糊劑后自行固化形成磷灰石，具有良好的生物相容性、骨引導性、可塑形性和抗壓性，是骨缺損區域理想的生物充填材料[3-4]。但是，單純的CPC材料存在缺乏誘導骨再生活性、體內降解速度較慢等問題，不適合牙槽骨或頜骨缺損修復。近年來研究表明神經多肽P物質(Substance P，SP)不僅是痛覺傳導分子，還是骨再生與改建的信號分子，能夠誘導骨髓間充質細胞向成骨細胞分化，并誘導血管新生[5-9]。據此，本研究采用SP、Ⅰ型膠原(Col- Ⅰ)與CPC模塊化仿生設計構建復合骨替代材料，觀察不同構建模式對材料修復頜骨缺損效率的影響。

1 材料與方法

1.1 模塊化復合材料的構建

自固化磷酸鈣人工骨(商品名：瑞邦骨泰)[國食藥監械(準)字2013第3460199號，上海瑞邦生物材料有限公司]；P物質(多肽氨基酸序列RPKPQQFFGLM- NH2，純度>98%)購自上海生工公司，配制工作濃度10-3mol/L；Ⅰ型膠原取材于SD雄性大鼠尾腱，5 mol/L醋酸溶解48 h，離心去除雜質，雙蒸水半透膜(截留分子量25 000)透析72 h去除醋酸，獲得3%膠原溶液；膠原溶液-60 ℃凍干24 h，剪切獲得1 mm×1 mm×1 mm膠原海綿顆粒；膠原溶液內加入0.1 mol/L濃度MES配制中性緩沖液，再加入10-3mol/L SP及共價交聯劑EDC/NHS，SP/EDC/NHS摩爾比1∶1.2∶0.6，磁力攪拌反應24 h，雙蒸水半透膜透析72 h去除交聯劑，獲得共價交聯SP/Col- Ⅰ溶液。

CPC粉與各種固化液混合調拌(粉/液質量體積比：3.0 g/ml)制成糊劑后，充填于直徑8 mm、厚度2 mm不銹鋼模具中，自行固化6 h后脫模，獲得實驗試件。對照組試件采用原配售固化液與CPC調拌制備，記為A組。實驗組共5 組：采用共價交聯SP/Col- Ⅰ溶液與CPC調拌制備試件記為B組；將SP多肽按照10-3mol/L濃度直接加入3%膠原溶液混合后再與CPC調拌制備試件記為C組；SP加入普通固化液與CPC調拌制備糊劑，再混合50%體積比的Col- Ⅰ海綿顆粒，固化制備試件記為D組；SP加入普通固化液與CPC調拌制備試件記為E組；3%膠原溶液與CPC調拌制備試件記為F組。

1.2 材料試件掃描電鏡觀察

各組試件取橫斷截面干燥噴金，掃描電鏡(德國卡爾蔡司公司)1 000 倍觀察試件的內部超微結構，D組試件內膠原海綿顆粒截面采用300 倍觀察(圖 1)。

圖 1 掃描電鏡下各組材料橫斷面形貌

1.3 兔頜骨缺損修復動物實驗

將30 只成年新西蘭兔(第四軍醫大學實驗動物中心提供)隨機分為6 組，每組5 只。術前給予頭孢唑啉鈉肌注，麻醉后取頜下切口顯露一側下頜骨體部，用環鉆于第一至第三臼齒區制備8 mm直徑圓形半層頜骨缺損，分別植入預制的各組材料試件，分層縫合傷口。術后進軟食，抗生素注射3 d預防感染，7 d拆除縫線。8 周后4%戊巴比妥靜脈注射處死動物，取下頜骨體，標本固定備用。

1.4 骨缺損影像學檢查

使用Micro CT(德國西門子公司)對標本進行掃描重建，精度40 μm，觀察骨缺損區材料降解與新骨再生情況。

1.5 骨缺損組織學檢查

頜骨標本甲酸-甲酸鈉混合溶液脫鈣2 周，常規包埋切片，Masson三色法染色，光學顯微鏡觀察缺損區組織學變化。

1.6 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件行ANOVA分析，P<0.05時認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 復合材料內部結構

掃描電鏡顯示：A組材料微孔隙多為數微米直徑，無超過50 μm孔隙；B、C、F組結構相似，空隙直徑較大，多為50 μm左右；D組可見Col- Ⅰ海綿顆粒在CPC內形成300～1 000 μm大孔隙；E組與A組結構相似(圖 1)。

2.2 影像學檢查結果

Micro- CT顯示植入體內8 周后，A組材料僅表面出現少量坑狀吸收，新生骨骨量較少。B組材料形態較完整，新生骨量少。C組材料吸收較明顯，新生骨骨量較多。D組材料吸收明顯，原有形態喪失，吸收部分已被大量新生骨組織占據。E組材料表面吸收，被較多新生骨組織覆蓋。F組材料不規則吸收，部分新骨長入。Micro- CT數據統計分析結果證實，D組新生骨量及材料降解率明顯優于其余5 組，存在統計學差異(P<0.05)(圖 2)。

2.3 組織學檢查結果

Masson三色法染色顯示，A組材料周邊有引導骨爬行替代表現。B組材料周邊僅有少量新骨再生。C組材料吸收較明顯，有較多新骨長入。D組材料形態喪失，大量新骨組織包裹殘余材料。E組有較多新骨與材料緊密結合。F組材料有不規則新骨長入(圖 3)。

3 討 論

理想的的骨替代材料應具備“4F”性能：Form即能夠填充復雜三維骨缺損，Fixation即能夠承載一定壓力，Function即能夠與周圍骨組織功能性整合，Formation即能夠誘導促進骨再生[8]。模塊化設計構建骨替代材料是實現這些目標的有效途徑，并有利于臨床轉化應用，其中的關鍵問題包括材料的骨引導能力、骨誘導能力、孔隙結構、生物相容性及安全性等。

CPC固化后形成磷灰石結晶，與天然骨組織的無機成分類似，具有良好的骨引導性及生物相容性，但單純CPC缺乏誘導骨再生能力，且降解速率緩慢[11]。Ⅰ型膠原是天然骨中最主要的有機成分，常用作組織工程載體，利于成骨細胞粘附生長和增殖分化[12-13]。但單純膠原材料無法獲得足夠的機械強度。本研究擬采用仿生模塊化設計構建復合骨替代材料，提高材料綜合性能，使其具備良好的成骨轉化效率，其中，CPC作為無機成分，可塑形填充缺損、保障材料強度以及提供骨引導功能，Ⅰ型膠原作為有機成分，可調整材料內部結構并提供骨引導、骨誘導功能，P物質作為生物活性分子，可提供體內誘導骨再生和血管新生功能。

圖 2 各組材料植入8 周后Micro- CT掃描三維重建對比(藍綠色： 材料； 黃色： 新生骨組織)

圖 3 各組材料植入8 周后組織學表現對比

材料孔隙結構和孔隙率是影響骨替代材料成骨能力的重要因素。研究表明，使用膠原溶液調拌固化CPC可以優化材料內部微孔隙結構，增大孔隙直徑至50 μm左右。理想的成骨材料孔隙直徑應達到200～900 μm[14]，為此，我們采用膠原海綿顆?；烊隒PC糊劑，固化后電鏡觀察確定實現預期目的，動物實驗也表明大孔隙結構顯著增強材料降解和新骨再生。值得指出的是，材料強度和材料孔隙結構是相對的兩面，膠原海綿顆?；烊隒PC會降低材料的整體強度，但本研究前期相關生物力學測試表明，其強度與松質骨類似，因此適合于初期負載強度較低的牙槽骨缺損修復。

與BMP等常用骨誘導高分子蛋白相比，SP是一種小分子多肽，具有易于合成、保存等優點，使用成本較低。SP體內水解半衰期時間約為5 min[15-17]，因此，SP需要合適的運載、定位、緩釋系統以保持其穩定誘導成骨作用。本研究設計中，通過蛋白共價交聯技術，將Ⅰ型膠原分子與SP互相連接形成大分子結構，意圖避免SP過早水解[18-19]。但在動物實驗中發現，與直接添加SP多肽至CPC復合材料內部的3 組相比(C組、D組、E組)，Col- Ⅰ/SP共價交聯組(B組)的成骨效果最差。分析其原因應為共價交聯過度限制了SP的釋放，導致其活性減弱甚至喪失。CPC本身即是一種良好的蛋白、藥物運載緩釋材料，其固化反應溫和，不影響蛋白活性，固化后孔隙微小，可以阻擋蛋白水解酶等大分子通過，隨CPC逐漸降解，其中活性分子即可緩釋發揮作用[20]。

綜上所述，模塊化設計構建由CPC、SP和Col- Ⅰ組成的復合材料具有誘導骨再生活性，并促進材料體內降解；材料構建模式影響其內部結構和活性分子SP緩釋，進而影響材料誘導成骨效率；CPC、SP及Ⅰ型膠原海綿構建的多孔材料可能在牙槽骨缺損修復方面具有良好應用潛力。