脂肪干細胞促進可注射性“軟骨細胞磚-富血小板血漿”復合體形成異位軟骨的實驗研究

李治冶 董巖 馮曉珂 曹強 吳煒 巴睿愷 趙銥民

大量的研究采用組織工程技術將種子細胞負載于支架材料，成功地實現了軟骨再生[1]。然而，現有的方法很難實現微創，可注射性軟骨細胞磚-富血小板血漿(chondrocyte bricks- platelet rich plasma, CB- PRP)復合體，作為一種完全自體來源的組織工程復合體，可負載骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)通過皮下注射的方式可實現軟骨再生[2-3]。不過，BMSCs因取材較難、數量相對有限等因素阻礙了其進一步的臨床應用[4]。脂肪干細胞(adipose- derived stem cells, ADSCs)可以從皮下組織中大量分離獲取，并具備骨向、軟骨向和脂肪向等多項分化潛能[5]。因此在軟骨再生領域，ADSCs被認為是一種更理想的種子細胞。本研究把ADSCs負載于CB- PRP復合體中，探究其能否作為種子細胞促進異位軟骨的形成。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

成人ADSCs、成人BMSCs(Cyagen)；成人軟骨細胞(Sciencell，美國)；高糖DMEM培養基、胰酶、雙抗、PBS緩沖液(Hyclone，美國)；胎牛血清(Gemini，美國)；抗壞血酸、檸檬酸鈉(Sigma，美國)；凝血酶(Biomedical，西班牙)；細胞培養箱(Thermo Scientific，美國)；顯微鏡電腦分析系統(Nikon CX J30，日本)。

1.2 軟骨細胞磚的制備與組織學鑒定

成膜培養軟骨細胞約15 d后，用多片刀切割器將細胞膜片切割成面積約為1 mm2小顆粒，即CB。PBS沖洗兩次后重懸于PBS中待用。取適量CB置于4%多聚甲醛中固定24 h后做石蠟切片，經HE和Safranin- O染色后鏡下觀察。

1.3 PRP的提取和制備

挑選健康志愿者，簽署知情同意書。配制3.8%檸檬酸鈉抗凝液，取肘正中靜脈血9 ml后加入1 ml抗凝液。兩步離心法制備PRP：靜脈血以1 800 r/min離心8 min后分為3 層：血細胞層(底層)、PRP層(中層)和乏血小板血漿層(頂層)。棄掉底層后以3 600 r/min離心8 min，留下底層1/4為PRP，置于冰中待用。

1.4 “干細胞- CB- PRP”復合體的構建及異位成軟骨實驗

1.4.1 “干細胞- CB- PRP”復合體的構建 將ADSCs和BMSCs分別擴增培養，第2代細胞用于后續實驗。

實驗組(ADSCs- CB- PRP)：將約2.25×107個ADSCs，軟骨細胞磚(原始軟骨細胞數量為7.5×106個)與500 μl PRP混合后吸入2 ml注射器，加入50 μl凝血酶混勻后待其凝結。對照組(BMSCs- CB- PRP)：將約2.25×107個BMSCs，軟骨細胞磚(原始軟骨細胞數量為7.5× 106個)與500 μl PRP混合后吸入2 ml注射器，加入50 μl凝血酶混勻后待其凝結。

1.4.2 裸鼠背部皮下注射實驗 6～8 周齡雄性裸鼠10 只，隨機分為2 組。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，2 組復合體分別通過16G針頭注射至實驗組和對照組裸鼠背部皮下組織。

1.4.3 “干細胞- CB- PRP”復合體的大體形態觀察

12 周后處死裸鼠并取材，觀察比較2 組復合體在形態、色澤、光滑度和彈性等方面的異同。

1.4.4 “干細胞- CB- PRP”復合體的組織學分析 將標本在4%多聚甲醛固定24 h后浸入10%EDTA脫鈣處理2 周，石蠟包埋切片后，進行HE、Safranin- O和TB染色觀察，并對Safranin- O和TB染色陽性區域面積進行定量計算。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 軟骨細胞磚的組織學觀察

培養約15 d后，軟骨細胞形成白色半透明細胞膜片，表面平整且無褶皺、破潰(圖 1A)。切割后，軟骨細胞膜片形成一致的顆?；败浌羌毎?細胞外基質”復合體，即軟骨細胞磚(圖 1B)。HE染色顯示軟骨細胞磚在垂直方向上由2～4 層圓形的軟骨細胞構成，周圍環繞有豐富的細胞外基質，其厚度約為50～90 μm(圖 1C)。Safranin- O染色顯示細胞外基質中顯示大量均勻的桔紅色深染區域(圖 1D)。

A： 軟骨細胞膜片; B： 軟骨細胞磚; C～D： 軟骨細胞磚的HE和Safranin- O染色

2.2 大體形態觀察結果

經凝血酶激活后，流動的復合體逐漸凝結成凝膠樣結構(圖 2A)。注射后，復合體具有足夠的機械強度，可在裸鼠皮下維持一定的大體形態(圖 2B)。經過12 周的體內生長，2 組復合體均可觀察并觸及裸鼠背部明顯的半圓形隆起(圖 2C、2D)。與周圍組織分離后，2 組復合體均呈現輪廓規則、表面光滑、具有彈性的乳白色半透明的軟骨樣形態。此外，2 組復合體均與周圍組織實現了良好的融合，復合體表面及周圍可見明顯的血管分布，表明2 組復合體均可在動物體內存活并生長，無明顯吸收和變形(圖 2E、2F)。

2.3 組織學結果

HE、Safranin- O及TB染色結果顯示，2 組復合體均觀察有較大較圓的成熟軟骨細胞位于軟骨陷窩內，成群分布在中央，周圍包繞豐富的細胞外基質，Safranin- O和TB染色在細胞外基質中呈強陽性，符合軟骨的典型組織學表現。較小較扁的幼稚軟骨細胞尚未成熟，單個分布在周圍，細胞外基質較少，Safranin- O和TB染色顏色稍淺，呈弱陽性(圖 3A～F)。定量分析顯示，Safranin- O染色陽性區域面積在實驗組占總面積的66.10%±7.81%；在對照組占62.11%±6.39%(P>0.05)(圖 3G)。TB染色陽性區域面積在實驗組占總面積的61.85%±8.22%；對照組占57.26%±7.63%(P>0.05)(圖 3H)。

A： 凝血酶激活后的復合體; B： 注射后裸鼠背部可見明顯隆起; C～D： 2 組復合體在裸鼠體內生長12 周; E～F： 2 組復合體均呈現軟骨樣大體形態

圖 3 “干細胞- CB- PRP”復合體的組織學觀察與檢測

3 討 論

對于頜面部軟骨組織的缺損修復，傳統的手術方法往往造成明顯的創傷和疤痕[6]?，F有的方法是將種子細胞負載于支架材料并加入相應細胞因子，采用組織工程的方法來改善和提高新生軟骨的特性[2]。目前的支架材料雖然具有良好的生物降解性和生物活性，但卻無法有效地實現微創修復。

前期研究發現將成膜培養的軟骨細胞制備成CB并與PRP混合后，再將擴增培養的軟骨細胞負載至其中，形成的“軟骨細胞- CB- PRP”復合體可通過注射的方式實現軟骨組織的再生[2];為了優化實驗方法并減少軟骨細胞的用量,用單純擴增的BMSCs取代軟骨細胞，構建出“BMSCs- CB- PRP”復合體，成功實現軟骨組織再生，并能夠有效改善復合體中央的血流灌注情況[3]。該復合體能夠在體內形成軟骨發育的微環境，通過啟動機體自身的愈合機制進而形成軟骨組織，在保證移植物具有足夠機械強度的同時，又確保其具有良好的塑形性和可注射性以滿足頜面部軟骨組織不同形態缺損的微創修復[4，7]。BMSCs雖然作為經典的種子細胞在軟骨缺損修復領域被大量研究，但是其取材困難、細胞數量相對有限和分化能力隨年齡退化等弊端往往阻礙其實現進一步的臨床轉化。

Zuk等[5，8]研究發現ADSCs同樣具有形成軟骨樣基質的能力。ADSCs不僅具備軟骨向分化的能力，而且在人體中含量更豐富、獲取更容易、隨年齡增長而出現分化能力退化的程度更為緩慢[9-10]。因此本研究把ADSCs負載于CB- PRP復合體，探索其作為種子細胞實現頜面部軟骨組織微創修復的可行性。

通過實驗發現，經過約15 d的培養，組織學結果顯示軟骨細胞不僅可以貼壁生長，還可以在垂直方向上通過細胞擴增和細胞外基質的沉積實現CB在厚度上的增加，大量的糖胺多糖被分泌至細胞外參與了細胞外基質的形成。CB中包含有大量的軟骨細胞和豐富的細胞外基質。激活后，CB- PRP復合體形成的凝膠樣結構具有高度的可塑性，可將干細胞穩定負載于其中。ADSCs- CB- PRP和BMSCs- CB- PRP 2 組復合體經過體內12 周的生長均能夠完成組織重塑，并與機體實現融合。2 組復合體均具呈現良好的軟骨樣形態，無明顯吸收和變形。組織學結果顯示，2 組復合體均呈現軟骨組織的典型組織學表現并有新生的軟骨細胞形成。對Safranin- O和TB染色陽性區域面積百分比進行定量分析顯示，ADSCs- CB- PRP組較BMSCs- CB- PRP組形成了更多的軟骨組織，但無統計學差異。因此，我們認為ADSCs可以作為一種理想的種子細胞應用于可注射性細胞磚技術中，ADSCs- CB- PRP復合體能夠在動物體內形成具有良好形態、機械強度和軟骨表型的新生組織工程軟骨。

ADSCs的引入推進了可注射性細胞磚技術的臨床轉化，為其在頜面部微創軟骨修復領域的應用提供了新的方法和途徑。不過，如何再進一步減少軟骨細胞的用量和培養的難度則需更多的研究去探索。此外，復合體內新生軟骨細胞的來源，ADSCs的最終去向及其軟骨形成機制仍需要進一步的研究和探討。