基于動物偏好指數與電子舌評價關聯的中藥澀味整體量化表征方法研究

韓雪+姜紅+林俊芝+韓麗+熊茜+焦姣姣+張瑩瑩+張定堃+楊明

[摘要]目前的澀味表征主要采用感官評價，具有高度的主觀性與模糊性，缺少客觀、統一、量化的評價指標，不利于澀味強度的精準表征。為此，該文建立了基于動物偏好指數與電子舌評價體內外關聯的中藥澀味整體量化表征方法。首先，采用澀味標準物鞣酸進行雙瓶喜好實驗的方法學優化及驗證，確定標準實驗動物為140～180 g的雌性大鼠，得到鞣酸濃度-動物偏好指數的函數關系Y=ln（1.682 6-0.441 66X），r=0.997 3。然后，利用優化后的方法對典型澀味中藥訶子、矮地茶、青果、兒茶、大腹皮進行評價，計算其2 g·L^-1時的澀味強度分別相當于0.56，0.29，0.24，0.34，0.25 g·L^-1鞣酸的澀度。最后，采用電子舌進行驗證，將其主成分分析（PCA）圖中歐氏距離與樣品偏好指數及換算的鞣酸濃度分別進行pearson相關分析，發現具有較高的相關性。上述體內、體外實驗結果相互佐證，共同表明由動物偏好指數換算得到的結果客觀、真實、可靠。該方法的建立，為中藥澀味的精準量化以及掩味效果的客觀評價提供了可靠的工具，也為藥品、食品領域其他味覺的量化評價提供了新的思路與范例。

[關鍵詞]澀味； 量化表征； 偏好指數； 雙瓶喜好； 鞣酸濃度； 電子舌； 掩味

[Abstract]Current evaluation method for astringency is mainly focused on human sensory evaluation. However， it is subjective， vague， and short of assessment indicators for objective quantification. In this paper， the quantification method for astringent intensity of traditional Chinese medicine was established based on the animal preference index and electronic tongue in vitro and in vivo. Firstly， the standard substance of astringency， tannic acid， was used for the methodology optimization and validation of two-bottle preference test. It was determined that the standard experimental animals were female rats of 140-180 g. The functional relationship between concentration of tannic acid and preference index was obtained Y= ln（1.682 6-0.441 66X）， r=0.997 3. Then the typical astringent Chinese herbs Chebulae Fructus， Ardisiae Japonicae Herba， Canarii Fructus， Catechu， and Arecae Pericarpium were evaluated by the optimized method. Their corresponding concentration of tannic acid was converted by the concentration-preference index relationship through preference index. Their astringency was equivalent to 0.56， 0.29， 0.24， 0.34， 0.25 g·L^-1 tannic acid. Finally， the results were verified by electronic tongue. The correction analysis between Euclidean distance in PCA and preference index and concentration of tannic acid converted by samples showed a high correlation through pearson correlation analysis. The above results indicated that the method was objective， true and reliable. The method provided a reliable tool for the quantification of astringency and evaluation of taste masking effect for Chinese medicines， and also offered a new idea and model for the quantification of taste in the pharmaceutical and food fields.

[Key words]astringency； quantification； preference index； two-bottle preference test； concentration of tannic acid； electronic tongue； taste masking

澀味，是中藥常見的不良口感之一，在中藥中具有一定的普遍性，是影響中藥制劑口感的重要因素^[1]。為了區分澀味程度，前人經驗性地將澀味分級為極澀、澀、微稍等。然而，這種分類主要依賴受試者的個人感官認知，具有高度的主觀性與模糊性，缺少統一、客觀、量化的評價指標，不利于澀味程度的精準表征，也制約了對掩味效果的客觀評價。

現有的澀味評價主要包括體內實驗與體外實驗。在體實驗主要采用志愿者口嘗為主，該法最突出的優點在于能真實反映人體對味道的感知，但對受試人員的經驗要求較高，且受試人員往往存在明顯的個體差異，此外，部分樣品可能存在一定的毒性或刺激性，使得該法的應用受到諸多限制^[2]。研究表明，嚙齒類動物的味覺結構和喜好與人類非常相似，除了苦、甜、咸、鮮、酸這些基本味覺，澀味也能顯著地影響其對味覺物質的喜好與厭惡^[3]。動物偏好指數是基于雙瓶喜好實驗（two-bottle preference test）評價樣品口感的指標，其原理是基于動物對味覺喜好、厭惡的反應做出的相關舉動而進行判斷。雙瓶喜好實驗為替代人體志愿者做味覺評價提供了選擇^[4]。有研究者利用動物偏好實驗研究了鞣酸^[5]、綠茶^[6]對動物的飲水行為影響，而尚未有用于中藥澀味評價的研究。電子舌是近年發展起來的一種新型體外味覺評價技術。作為一種和人類味覺系統相仿的味道鑒別儀器，通過傳感器陣列產生響應電信號，經計算機模式識別系統處理數據，便可得到反映該樣品的特有味覺信息^[7-8]。電子舌最突出的優勢在于其檢測的靈敏與快捷，甚至能用于許多口嘗實驗無法區分的樣品鑒別。

綜合上述分析，課題組提出了一種基于動物偏好指數與電子舌評價體內外關聯的中藥澀味整體量化表征研究方法，研究裝置見圖1。首先，通過對動物偏好實驗的方法學進行研究，確定測定的最優參數，并建立標準物質鞣酸濃度與偏好指數的相關關系。其次，采用該法測定典型澀味藥物的偏好指數，并將其換算成對應的鞣酸濃度，實現評價標準的量化、統一。最后，采用電子舌實驗的歐式距離與偏好指數的相關性分析，證明了動物偏好實驗結果的可靠性。該研究方法的提出，為中藥澀味的精準量化以及掩味效果的客觀評價提供了可靠的工具，也為藥品、食品領域其他味覺的量化評價提供了新的思路與范例。

1 材料

1.1 藥物

訶子、矮地茶、青果、兒茶、大腹皮購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司，經成都中醫藥大學盧先明教授鑒定分別為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果實，紫金?？浦参镒辖鹋rdisia japonica （Thunb.） Blume的干燥全草，橄欖科植物橄欖Canarium album Raeusch.的干燥成熟果實，豆科植物兒茶Acacia catechu （L. f.）Willd.的去皮枝、干的干燥膏，棕櫚科植物檳榔Arera catechu L.的干燥果皮；鞣酸（2015113001，AR）購于成都市科龍化工試劑廠。

1.2 動物

SD大鼠（SPF級），由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供，實驗生產許可證號SCXK（川）2013-15。動物飼養及實驗在空調環境中進行，溫度控制在（25±0.5） ℃，濕度55%±5%。

1.3 儀器

α-AstreeⅡ型電子舌（法國Alpha MOS公司），包含ZZ，AB，GA，BB，CA，DA，JE 7根交叉敏感電位傳感器陣列；Ag/AgCl參比電極（Metrohm，Ltd.）；48位自動進樣器；機械攪拌器（Metrohm，Ltd.）；信號處理系統（Alpha MOS）以及模式識別軟件（Alpha M.O.S.，Version 2012.45）。

BS110S型電子分析天平（德國Sartorius公司），Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

2 方法與結果

2.1 澀味標準物的選擇

目前公認的澀味化合物主要有表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、鞣酸、硫酸鋁鉀等。而EGCG存在苦的兼味，其濃度高低對味道的表達有影響；同時其為茶葉的主要成分，具有成癮性，長期攝取會對實驗測量結果造成誤差^[9-10]。硫酸鋁鉀的澀味主要是水解形成帶正電的膠體狀氫氧化鋁，通過與帶負電的蛋白質吸附沉淀而產生收斂感，與酚類化合物的澀味形成機制明顯不同。而本文研究對象的澀味物質基礎主要為酚類化學物^[11]，因此，最終選擇鞣酸作為澀味標準物。

2.2 雙瓶喜好實驗方法學優化與驗證

雙瓶喜好實驗為在動物飼養籠外放置相同的 2個外形一致的飲水瓶，根據受試動物對不同樣品的飲水量（通常與對照品組相比較）及飲水時的自身反應程度（搖頭、躁動等一些逃避反應）進行綜合評價。研究表明，不同性別、體重對味覺有不同的敏感性^[12-13]，因而將性別、體重列為考察指標。測試方法參照美國Monell Chemical Senses Center的實驗方法^[14]。

2.2.1 鞣酸樣品溶液的制備

取鞣酸溶于去離子水中，分別制得質量濃度為0，0.25，0.5，1，2，4 g·L^-1的樣品溶液。

2.2.2 方法學考察

將SD大鼠單獨隔開飼養于25 ℃的恒溫環境7 d，正常喂食及去離子水。實驗時，在飼養籠蓋兩邊放置分別裝有樣品和去離子水的水瓶。觀察記錄24 h內2瓶的消耗體積。然后調換雙瓶的位置，再次記錄24 h內雙瓶的消耗量。測試下一樣品前，將2個水瓶均裝去離子水飼養48 h。測試過程中，為了克服“飽和效應”，樣品濃度由低到高進行。偏好指數計算公式：偏好指數=樣品溶液消耗量/消耗總量。

偏好指數大于0.5，表明實驗對象對該溶液呈喜好狀態；偏好指數小于0.5，則表明呈厭惡狀態。偏好指數與0.5的差值的絕對值越大，喜好或厭惡程度越高。

2.2.2.1 性別考察 將180～220 g 的SD大鼠，分為雄性組、雌性組，每組各10只，進行實驗，比較實驗結果的組間差異來優選動物性別。

2.2.2.2 體重考察 根據性別考察結果，將140～180，180～220，220～260 g的SD大鼠分為3組，每組10只，進行實驗，比較實驗結果的組間差異來優選動物體重。

2.2.2.3 鞣酸濃度-偏好指數曲線的考察 根據性別及體重考察結果，選擇合適的動物進行驗證，得到鞣酸濃度-偏好指數曲線。

性別考察結果見圖2，3，圖2中箱圖表示平均值±標準差，其中圓點代表了每只動物偏好指數的原始數值，圖3中球形面積代表了動物對各濃度組RSD的大小，球形面積越大，數據變異性越大。整體分析6個濃度鞣酸組的動物偏好指數發現，雄性組的RSD整體高于雌性組，說明雄性對澀味的反應變異較大，而雌性較為穩定，因而選擇雌性大鼠進行后續實驗。

體重考察結果及驗證見圖4，5。整體分析6個濃度鞣酸組的偏好指數發現，140～180 g組RSD低于180～220 g組、220～260 g組，說明140～180 g組的大鼠對澀味反應較為穩定。因而確定140～180 g組的雌性大鼠為最優選擇。

鞣酸濃度與偏好指數的相關性分析實驗結果見圖6。由圖可以看出，在0～1 g·L^-1，偏好指數隨濃度的增加而下降，說明實驗動物對高濃度鞣酸的厭惡程度明顯增加。但當鞣酸濃度超過1 g·L^-1時，偏好指數并不隨濃度的增加而繼續下降，說明此時大鼠對鞣酸的厭惡程度已經很高。因而選擇對前4個濃度鞣酸的濃度與偏好指數進行擬合，結果見表1。優選出Log2P2模型，濃度-偏好指數方程為Y=ln（1.682 6-0.441 66X），r=0.997 3。

2.3 樣品的澀味定量表征

將干燥的訶子、矮地茶、青果、兒茶、大腹皮粉碎成粗顆粒，分別稱取各藥物2 g，加去離子水200 mL，浸泡30 min，加熱回流1 h，放冷，過濾，定容至1 000 mL，備用。采用雙瓶喜好實驗測定偏好指數，結果見圖7A。然后將偏好指數代入鞣酸濃度-偏好指數方程，換算得到與樣品澀度相當的鞣酸濃度，結果見圖7B。

由結果可知，2 g·L^-1訶子、矮地茶、兒茶、青果及大腹皮分別相當于0.56，0.29，0.34，0.24，0.25 g·L^-1鞣酸的的澀度；即1 mg訶子、矮地茶、兒茶、青果及大腹皮分別相當于0.28，0.15，0.17，0.12，0.12 mg鞣酸的澀度。訶子的澀味明顯強于其他4種藥物。

2.4 結果的驗證

雙瓶喜好實驗為體內實驗，由于個體對澀味的敏感度不同，因而采用仿生味覺傳感器電子舌對結果進行體外的驗證。

2.4.1 電子舌分析方法^[15-16]

信號采集參數為采集溫度25 ℃，數據采集時間120 s，采集周期1 s，攪動速度1 r·s^-1。以超純水

為清洗液，每次測量樣品前清洗傳感器10 s。將以上5種澀味中藥溶液與相應的濃度鞣酸溶液經0.45 μm微孔濾膜過濾后置于50 mL標配燒杯中，進行測定。每份樣品按上述方法平行測定10 次，為得到穩定可靠數據，取其中最后3次數據作為輸出值；每份樣品的3 次輸出值取平均值作為后期處理數據。

2.4.2 驗證結果

驗證結果見圖8。圖8A顯示，電子舌傳感器的RSD均小于2%，說明儀器穩定性良好。采用主成分分析（PCA）對電子舌結果進行分析，見圖8B，并采用Simca-p 11.0軟件作圖。主成分1貢獻率為81.47%，主成分2為11.49%，前2個主成分包含了全部變量信息的92.96%。采用歐氏距離（Euclidean distance，D）^[17]來表征樣品的澀度。歐氏距離是指在m維空間中2個點之間的真實距離。二維和三維空間中的歐氏距離的就是兩點之間的距離，計算公式如下。

其中k表示每個樣本有k個變量，x_i表示第1個樣本在第i個變量上的取值；y_i表示第2個樣本在第i個變量上的取值。計算結果見圖8B，距離（D_s）越短，表明二者澀度越相近。由歐氏距離推斷澀味強度關系為：訶子>兒茶>矮地茶>青果>大腹皮。

將樣品的歐氏距離與偏好指數進行Pearson 相關性分析（SPSS 22.0軟件），擬合方程為Y=0.320 8+0.021 9X，r=0.961 7；歐氏距離與同樣品澀度相同的鞣酸濃度相關性方程為Y=0.699 4-0.075X，r=0.972 7。歐氏距離與二者的相關性均較高，說明電子舌結果與動物偏好實驗結果一致性高。電子舌實驗結果證明了動物偏好實驗結果的可靠性。

3 結論與討論

3.1 澀味整體量化表征方法的研究意義

課題組統計了《中國藥典》2015年版（一部）^[18]正文部分收載的514味中藥，發現真實滋味標有澀味的共有106味，占藥物總數的20.5%；《新編國家中成藥》^[19]（第2版）收載的近7 000種中成藥種，在性狀項下標明澀味的有667個，約占總數的10%。統計結果表明澀味藥在中藥中組成比例較大。如何科學、客觀地評價澀味，突破感官評價主觀性與模糊性的瓶頸，顯得尤為迫切。

動物偏好實驗利用了實驗動物對外界刺激趨利避害的特性，是體內味覺整體水平的真實反映。通過性別、體重等因素的考察，有助于縮小動物個體差異對實驗結果的影響，提高數據的整齊性。采用鞣酸為澀味標準物質，建立鞣酸濃度-偏好指數的相關性，將樣品濃度轉換為相應的鞣酸濃度，解決了評價標準不統一、指標難以量化的難題，避免了對樣品復雜多酚組成及含量的分析，實現了對樣品澀味強度的整體量化表征，體現了復雜問題簡單化、簡單問題科學化的特點。電子舌評價為體外味覺的反映，能更為準確地反映樣品間的細微差異。動物偏好實驗與電子舌實驗的相關性研究，從體內、體外2方面對同一實驗結果進行分析，相互驗證，保證了結果的可靠性與科學性。

3.2 澀味整體量化表征方法的應用價值

澀味整體量化表征方法的研究，為澀味掩味效果的客觀評價、澀味藥品食品的質量評價提供了科學的評價手段。多酚口含片是中藥口含片中的特殊類別，具有明顯的澀味，多用于口腔及咽喉炎癥的治療，如余甘子喉片、藏青果喉片、三果湯含片、喉舒口含片等。這類含片在口腔中停留時間較長，一般10～15 min，多酚類物質的不斷釋放使得口腔黏膜持續收縮，產生明顯的澀味。應用此模型，將各種多酚物質轉換為鞣酸的相對含量，研究制劑處方中輔料因素與工藝因素對澀味的影響規律，將簡化制劑處方的研究難度，促進對澀味的精準控制，使其停留在可接受范圍內，有力推動多酚口含片從“良藥澀口”向“良藥可口”的轉變。澀味既是一種不良味覺，也是一種風味，不但在中藥中普遍存在，在水果中也普遍存在，如柿子、李子、葡萄、藍莓、野櫻莓等。但究竟是風味還是不良味覺，與濃度密切相關，也與受試者對多酚的忍耐度密切相關。應用本研究方法，可以進一步劃分極澀、澀、微澀的濃度范圍，為建立統一的澀味評價標準提供參考，具有明顯的應用價值。

3.3 研究中的不足之處

本研究過程中，也存在一些不足之處。動物偏好實驗顯示澀味強度關系為：訶子>兒茶>矮地茶>大腹皮>青果；而電子舌中的澀味強度關系為：訶子>兒茶>矮地茶>青果>大腹皮。2種方法對5種藥物的澀味強度評價結果稍有不一致，主要表現在大腹皮與青果澀度的評價不一致，這可能由以下原因造成。首先，雙瓶偏好實驗結果顯示，青果的偏好指數僅略大于大腹皮，而實驗中動物的個體誤差可能對結果產生了影響；其次，電子舌雖具有客觀、重復性好、檢測快速等優點，但它實際感知的是味覺溶液離子強度、電信號等物理性質的變化，不能完全反映味覺的生理過程，因而可能產生與體內實驗不一致的結果。此外，由于實驗設計過程中考慮不足，未能充分估計偏好指數-鞣酸濃度的敏感濃度范圍，僅以4個濃度點進行了建模，需要在后續試驗中進一步完善優化。

總體而言，本文通過方法學考察、偏好指數-鞣酸濃度建模以及電子舌結果驗證，構建了體內外關聯的澀味整體量化表征方法，該研究的開展有利于實現中藥澀味的統一量化以及分級評價的精準表征，有助于創建更為客觀的中藥澀味分級標準，對于推動中藥性狀評價的現代化具有重要意義。

[致謝]文章得到四川大學化學學院鄒文銓教授的指導。

[參考文獻]

[1]林俊芝，張定堃，段渠，等. 中藥澀味的形成原理及掩蔽技術的研究概況[J].中草藥，2014，45（18）：2716.

[2]王鑫， 張定堃， 林俊芝， 等. 口腔給藥系統中口感的評價方法研究進展[J]. 中草藥， 2015， 46（15）：2167.

[3]Mueller K L，Hoon M A，Erlenbach I， et al. The receptors and coding logic for bitter taste [J]. Nature，2005，434（7030）：225.

[4]Noorjahan A， Amrita B， Kavita S. In vivo evaluation of taste masking for developed chewable and orodispersible tablets in humans and rats [J]. Pharm Dev Technol， 2014， 19（3）：290.

[5]Ramírez M， Toledo H， Obrequeslier E， et al. Aversive effect of tannic acid on drinking behavior in mice of an inbred strain： potential animal model for assessing astringency [J]. J Agr Food Chem， 2011， 59（21）：11744.

[6]熊藝姣. 綠茶長期暴露改變小鼠味覺系統及味覺偏好行為研究[D].杭州：浙江工商大學，2013.

[7]Woertz K， Tissen C， Kleinebudde P. Taste sensing systems （electronic tongues） for pharmaceutical applications [J]. Int J Pharm， 2011， 417：256.

[8]Hayashi N， Chen R G， Ikezaki H， et al. Evaluation of the astringency of black tea by a taste sensor system： scope and limitation[J]. Biosci Biotechnol Biochem， 2007，71（2）：587.

[9]童華榮，金孝芳，龔雪蓮. 茶多酚感官性質及其對茶葉澀味的影響[J].茶葉科學，2006，26（2）：79.

[10]Rossetti D， Bongaerts J H H， Wantling E. Astringency of tea catechins： more than an oral lubrication tactile percept [J].Food Hydrocolloids， 2009， 23：1984.

[11]Peleg H， Bodine K K， Noble A C. The influence of acid on astringency of alum and phenolic compounds [J]. Chem Senses， 1998， 23：371.

[12]Nesil T， Kanit L， Pogun S. Bitter taste and nicotine preference： evidence for sex differences in rats [J]. Am J Drug Alcohol Abuse， 2015， 41（1）：57.

[13]Miura H， Ooki M， Kanemaru N， et al. Decline of umami preference in aged rats [J]. Neurosci Lett， 2014， 577：56.

[14]Bachmanov A A， Tordoff M G， Beauchamp G K. Sweetener preference of C57BL/6By J and 129P3/J mice [J]. Chem Senses， 2001， 26（7）： 905.

[15]Xu M， Yang S L， Peng W， et al. A novel method for the discrimination of Semen arecae and its processed products by using computer vision， electronic nose， and electronic tongue [J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2015， 2015：753942.

[16]Lorenz J K， Reo J P， Hendl O， et al. Evaluation of a taste sensor instrument （electronic tongue） for use in formulation development [J]. Int J Pharm， 2009， 367：65.

[17]Zhang A X， Tian S Y， Deng S P， et al. The differential degree test： a novel methodology for electronic tongue applications [J]. Sensor Mater， 2012， 24（8）：457.

[18]中國藥典. 一部[S]. 2015.

[19]宋明憲，楊明. 新編國家中成藥[M]. 2版. 北京： 人民衛生出版社，2011.

[責任編輯 孔晶晶]