熱毒寧注射液物理指紋譜研究及應用

伍蕊嗣+劉濤+覃盼盼+雍玲+寇強+鄭燕

[摘要]基于藥品的物理化學性質與其安全性、有效性及穩定性具有很強的相關性，該研究提出建立熱毒寧注射液物理指紋譜，提升其質量標準。采用物理化學的思路和方法對熱毒寧注射液進行質量研究，構建由8個指標（酸堿度、電導率、濁度、折光率、滲透壓摩爾濃度、表面張力、相對密度、運動黏度）組成的對照物理指紋譜，以雷達圖直觀展現，并對12批樣品進行驗證。發現3批效期內的熱毒寧注射液，其物理指紋譜符合要求，相似度高于0.999；另外過期的9批樣品，其物理指紋譜不滿足要求。結果表明物理指紋譜法可用于控制熱毒寧注射液的質量，對中藥注射液質量評價研究具有一定的示范作用。

[關鍵詞]熱毒寧注射液； 物理指紋譜； 物理化學； 質量標準

[Abstract]The method of physical fingerprint spectrum for Reduning injection （RI） was proposed in this paper to improve its quality standards based on the strong correlation between physicochemical properties of drugs， their safety， effectiveness and stability. The quality of RI was studied by the thought and method of physical chemistry. The physical fingerprint spectrum was visually showed by the radar map， and consisted of eight indexes （pH， conductivity， turbidity， refractive index， osmolarity， surface tension， relative density， and kinematic viscosity）. Then 12 batch of samples were verified. It was found that the physical fingerprint spectra of 3 batches of RI were in line with the standards within their validity time， with similarity above 0.999； in addition for the expired 9 batches of RI， their physical fingerprint spectra did not meet the standards. The results showed that physical fingerprint spectrum can be used for the quality control of RI， with a certain exemplary role in the quality evaluation of traditional Chinese medicine injection.

[Key words]Reduning injection； physical fingerprint； physical chemistry； quality standards

中藥注射液被廣泛運用于臨床并顯示出很好的治療效果^[1]?？v觀相關技術要求，在中藥指紋圖譜應用于中藥質量控制之前，中藥注射液質量控制體系的核心是化學成分定性定量控制，在此思想的指導下，我國中藥注射液的藥學研究論文均著重對其所含的化學成分進行分離、鑒定及含量測定，但是這些成分的含量高低與產品安全性及和有效性的相關性如何，尚無明確的研究結論。且中藥化學對照品分離難度大、單體不穩定難以供應、供應價格高或由于檢驗太煩瑣等原因，難以很好地應用到中藥注射液實際質量監控和評價中^[2]。目前一些新的技術和方法如基于指紋圖譜多指標成分定量研究^[3]、一測多評技術等被引入中藥的質量評價中，但是上述方法目前存在一些缺陷，如指紋圖譜的模糊性、校正因子使用的局限性等。

物理化學是從物質的物理現象與化學現象的聯系入手來探求化學變化規律的一門科學^[4]，近年來，物理化學發展很快，分支較多，其中膠體化學、電化學、化學熱力學及化學動力學等部分與藥品的安全性、有效性及穩定性研究相關性很強，可用來對中藥注射液的質量進行評價，如藥液的黏度、藥液中所含的離子的沉降速度等與產品質量的穩定性相關，藥液中的電導率與藥液中離子的含量相關，藥液的滲透壓與溶血、肌肉刺激性相關，藥液的折光率與其所含的不溶性微粒相關等。

目前國內采用物理化學對熱毒寧注射液的質量進行控制的研究不夠，甚至缺乏相關的基礎研究，僅見少數其他品種的有關零星報道^[5-7]，本文提出了基于物理化學的中藥注射液質量標準體系的構建，對熱毒寧注射液的8個物理參數（酸堿度、電導率、濁度、折光率、滲透壓摩爾濃度、表面張力、相對密度、運動黏度）進行測定，并借由物理指紋譜的方法^[8]，更直觀地展現和評價中藥注射液質量，為中藥注射劑的質量控制提供新的思路。

1 材料

PHS-3C型精密pH計（上海日島科學儀器有限公司）；DDS-307型電導率儀（上海日島科學儀器有限公司）；TU-1810型紫外-可見光分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；A650型全自動折光儀（濟南海能儀器股份有限公司）；SMC 30C-1型滲透壓摩爾濃度測定儀（天津天河分析儀器有限公司）；DCAT21型表面張力儀（德國Dataphisics公司）；比重瓶（沈陽市華僑玻璃儀器廠）；BSA124S型電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；0號品氏黏度計（上海中立玻璃儀器有限公司）。

熱毒寧注射液（效期內批號160542，160543，160544，160545，160546，160547，160601，160602，160603，160604，160605，160606，160607，160608，160609，160610，160611，160612，160613，160614；效期外批號111201，120201，120701，120801，120802，120803，130201，130501，130801，江蘇康緣藥業股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 熱毒寧注射液物理質量屬性確定

根據熱毒寧注射液的物理化學性質與質量的相關性，篩選出8個物理參數。

氫離子濃度指數（pH），表示注射液的酸堿度，需控制在一定范圍內，是引起防止靜脈炎等不良反應的原因之一。

電導率（G），是用來描述物質中電荷流動難易程度的參數，用于控制注射液帶電離子濃度及總量。

濁度（t），是指水中懸浮物對光線透過時所發生的阻礙程度，用于控制藥液的澄明度。

折光率（N），是光線入射角正弦與折角正弦的比值，用于控制注射液中的不溶性微粒與澄明度等。

滲透壓摩爾濃度（O），反映的是溶液中各種溶質對溶液滲透壓貢獻的總和，用于控制注射液的溶血性和肌肉刺激性。

表面張力（σ），是液體表面任意二相鄰部分之間垂直于它們的單位長度分界線相互作用的拉力，用于描述注射液在輸液過程中出現的黏壁、油壁等現象，另外還與注射液中溶質混合溶解性、溶質溶解和增溶等有關。

相對密度（d），指在相同的溫度、壓力條件下，某物質的密度與水密度之比，用于控制藥液的純雜程度。

運動黏度（ν），是流體黏滯性的一種量度，是流體流動力對其內部摩擦現象的一種表示，可從一方面表示注射液的穩定性，也用于描述輸液過程中出現的黏壁、油壁等現象。

熱毒寧注射液的物理指紋譜由以上8個物理參數構成。

2.2 物理質量指標的測定方法

熱毒寧注射液物理指紋譜中參數的測定首選法定標準收載方法。

2.2.1 氫離子濃度指數（pH）^[9] 先依次用標準緩沖溶液（苯二甲酸鹽溶液、磷酸鹽溶液）標定pH計（26 ℃），再將用純凈水沖洗干凈并用濾紙拭干后的復合電極浸入熱毒寧注射液中，讀取示數。

2.2.2 電導率（G）^[9] 使用電導率的操作旋鈕進行校正后，再利用旋鈕依次進行溫度補償（26 ℃）和電極常數的設置，最后將鉑黑電極浸入熱毒寧注射液中，讀取示數，再將示數乘以電極常數（1.05），即得電導率。

2.2.3 濁度（t）^[10] 先繪制濁度標準曲線，即分別稱取1.000 g硫酸肼和10.00 g六次甲基四胺于2個100 mL量瓶中，用無濁度水溶解、定容，再分別吸取5.0 mL的上述2種溶液于100 mL量瓶中，混勻后靜置反應24 h后，用無濁度水定容，此溶液濁度為400 NTU。吸取400 NTU標準濁度溶液0.5，1.25，2.5，5.0，10.0，12.5 mL于6支50 mL具塞比色管中，加無濁度水至標線，搖勻后即得4，10，20，40，80，100 NTU標準濁度溶液，于680 nm波長下測定無濁度水和上述6個標準濁度溶液的吸光度，以濁度為橫坐標，吸光度為縱坐標，即得繪制濁度標準曲線。吸取2 mL熱毒寧注射液于10 mL量瓶中，用純凈水定容、搖勻，得供試液，在相同條件下測定供試液的吸光度，再由濁度標準曲線方程得到濁度的數值。

2.2.4 折光率（N）^[9] 按儀器說明書操作，在鈉光源的D線（589.3 nm）、20.0 ℃的條件下，先使用水進行校正，再將熱毒寧注射液裝入折光儀中，待測定溫度為20.0 ℃時，讀取示數，測量后再重復讀數2次，取3次讀數的平均值即可。

2.2.5 滲透壓摩爾濃度（O）^[9] 按儀器說明書操作，首先取適量純化水調節儀器零點，然后用300，600 mOsmol·kg^-1的標準溶液校正儀器，再取熱毒寧注射液測定，平行測定2次，取平均值即可。

2.2.6 表面張力（σ） 按儀器說明書操作，把熱毒寧注射液倒入玻璃杯中（26 ℃），將玻璃杯放在托盤的中間位置上，按“上升”鍵，使鉑金環深入到液體中5～7 mm處，按“停止”鍵停止，然后按“試驗”鍵，托盤和被測液體開始下降，顯示值將逐漸增大，當鉑金環脫離液面后，按下停止鍵，則在顯示屏的右側顯示當前實測表面張力值。

2.2.7 相對密度（d）^[9] 取潔凈、干燥并精密稱定質量的比重瓶，裝滿熱毒寧注射液，裝上溫度計（瓶中應無氣泡），置冰水浴中，降溫過程中，需補充熱毒寧注射液，待溫度計顯示20 ℃時，用濾紙除去側管周圍的水，立即蓋上罩，然后將比重瓶至水浴中取出，再用濾紙將比重瓶的外面擦凈，精密測定，減去比重瓶的質量，求得熱毒寧注射液的質量后，將其傾去，洗凈比重瓶，裝滿新煮沸的冷水，再照上法測得同一溫度時水的質量，熱毒寧注射液的質量除以水的質量即為熱毒寧注射液的相對密度。

2.2.8 運動黏度（ν）^[9] 取0號品氏黏度計，洗凈烘干備用，倒置黏度計，用手指堵住管口2，將管口1插入熱毒寧注射液中，用洗耳球自支管F端抽氣，使注射液充滿球C與A并超過測定線m₂，提出黏度計并迅速倒轉，抹去黏附于管外的注射液，用鐵架臺固定黏度計，使其垂直于冰水?。?0 ℃）中，并使水浴的液面高于球C的中部，放置15 min后，自管口1抽氣，使注射液充滿球A并超過測定線m₁，開放管口1，使注射液在管內自然下落，用秒表準確記錄液面自測定線m₁下降至測定線m₂處的流出時間。不重裝試樣，依法重復測定3次，另取同批次熱毒寧注射液同法操作，以先后2次取樣測得的總平均值t帶入公式：ν=Kt（K為黏度計常數），即得注射液的運動黏度。

2.3 物理質量指標的標準化轉換

由于用于構建物理指紋譜的8個物理參數的數值和量綱不同，為了方便定量直觀地利用雷達圖進行展示，參考藥典標準^[9]和物理化學參數手冊^[11]，確定每個指標的可能數值范圍，然后將其標準化至同一尺度，即0～10。

2.4 熱毒寧注射液物理指紋譜采集及對照物理指紋譜的構建

取效期內的17批熱毒寧注射液，按照2.2所確定的方法測定供試品各物理參數，并對數值進行標準化后，得物理指紋疊加圖譜，結果見圖1，以17批熱毒寧注射液各個標準化物理參數的平均值作雷達圖，即得對照物理指紋譜。

2.5 限度

2.5.1 相似度^{[12] 將17批熱毒寧注射液樣品的物理指紋譜與對照指紋譜進行相似度分析，經數據處理軟件matlab中夾角余弦法分析計算相似度，均大于0.999。效期內的熱毒寧注射液，按照2.2項所確定的方法測定供試品，所得物理指紋譜與對照指紋譜間的相似度應不低于0.999。}

2.5.2 物理參數 17批效期內熱毒寧注射液的8個物理參數值及標準化值的范圍，見表1。

這17批效期內的熱毒寧注射液，按照2.2項所確定的方法測定供試品，所得物理指紋譜，可用于評價其他批次熱毒寧注射液的各個指標是否同時滿足表1中的標準化范圍。

2.6 驗證

取12批熱毒寧注射液，按照2.2項所確定的方法測定供試品，繪制與對照物理指紋譜的疊加指紋譜，見圖2；所得物理指紋譜與對照指紋譜經夾角余弦法（matlab軟件）分析計算相似度，相關計算程序自行編寫，結果見表2。

可見，以上12批熱毒寧注射液樣品中，其中在有效期內的3批樣品，物理指紋譜相似度和物理參數值均符合限度要求；另外過期的9批樣品，物理指紋譜相似度和物理參數值都不符合限度要求。表明，本研究建立的對照指紋圖譜可以控制熱毒寧注射液的質量。

3 討論

本研究為了建立基于物理化學的中藥注射液質量控制標準和體系，以熱毒寧注射液為研究對象，初步探索了其物理化學性質，并借助雷達圖來直觀展現，研究結果表明，該法可作為評價熱毒寧注射液制備工藝可重復性和可控性的工具。

在熱毒寧注射液對照指紋圖譜驗證過程中發現，有9批樣品同時都不滿足物理指紋譜相似度和標準物理指標要求，為過期樣品；另外還有3批樣品，其物理指紋譜相似度和標準物理指標均滿足要求，為在效期內的樣品。驗證試驗表明本研究建立的物理指紋譜能夠對熱毒寧注射液的質量進行控制，但由于驗證樣品批次較少，其準確性有待進一步確認。

另外，從驗證結果中還可以發現，pH在效期內和外的熱毒寧注射液中變化不明顯，9批過期樣品中，只有一批樣品的pH超出限度，且只超出限度0.30%，而電導率、濁度、折光率、滲透壓摩爾濃度、表面張力、相對密度、運動黏度在效期內和外的熱毒寧注射液中呈現不同程度的變化，其中折光率判斷熱毒寧注射液的變化程度達100%，可推測折光率對藥品質量影響較大，可能是由于過期的樣品不溶性微粒的增多、澄明度降低?？梢?，物理指紋譜的8個指標能夠從一定程度上反映熱毒寧注射液的整體質量。

本文用學科交叉的研究技術，構建熱毒寧注射液物理指紋譜，可對不同批次間的熱毒寧注射液進行質量一致性評價。物理指紋譜包含的參數越多，所表征的質量信息越豐富，通過增加其他物理參數，如油水分配系數^[13-14]、粒度^[15-16]等可提高方法可靠性，但測試時間會延長，降低檢測效率，具體應用時，還需結合實驗條件、操作簡便性等綜合考慮，盡量選取對藥品質量影響較大的物理參數。另外為后續研究物理化學參數與藥物安全性的相關性奠定基礎。

[參考文獻]

[1]白曉菊. 從中藥注射劑不良反應看中藥的上市后再評價問題[J]. 中國藥物警戒，2009，6（2）：89.

[2]王智民，高慧敏，付雪濤，等. “一測多評”法中藥質量評價模式方法學研究[J]. 中國中藥雜志，2006，31（23）：1925.

[3]孟憲生，艾立，羅國安，等. 基于腰痛寧指紋圖譜多指標成分定量方法研究[J]. 中成藥，2009，31（5）：657.

[4]劉幸平. 物理化學[M]. 北京：中國醫藥出版社，2005.

[5]劉濤，蕭偉，王振中，等. 熱毒寧注射液中細菌內毒素的測定研究[J]. 中草藥，2009，40（10）：1585.

[6]徐玉玲，王永香，張靜，等. 熱毒寧注射液配伍后藥液的滲透壓研究[J]. 南京中醫藥大學學報，2011，27（3）：285.

[7]王永香，劉濤，王振中，等. 熱毒寧注射液與溶媒配伍穩定性研究[J]. 中國中藥雜志，2010，35（22）：2990.

[8]張毅，徐冰，孫飛，等. 中藥提取物粉末物理指紋譜研究及應用[J]. 中國中藥雜志， 2016，41（12）：2221.

[9]中國藥典. 四部[S]. 2015.

[10]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.中華人民共和國國家標準GB 13200-91[S]. 北京：中國標準出版社，1991.

[11]W M Haynes. CRC handbook of chemistry and physics on CD-ROM[M]. Ninety-sixth edition. Boca Raton：CRC Press， 2015.

[12]阿吉姑·阿布都熱西提，楚剛輝，徐云玲，等. 紫外指紋圖譜在維吾爾藥玫瑰花口服液質量控制中的應用[J]. 中國現代中藥，2011，13（10）：33.

[13]畢肖林，李瑤瑤，杜秋，等. 綠原酸表觀油水分配系數測定及在體腸吸收動力學研究[J]. 南京中醫藥大學學報，2013，29（6）：572.

[14]張倩怡，杜守穎，陸洋，等. 梔子提取物中梔子苷油水分配系數及大鼠腸吸收動力學研究[J]. 中國中藥雜志，2009，34（14）：1840.

[15]姜姍，倪健. 中藥注射液不溶性微粒的研究現狀與再認識[J]. 中國藥師，2009，12（10）：1465.

[16]呂強，柴家憶. 中藥靜脈注射液不溶性微粒研究[J]. 中國藥房，2002，13（9）：556.

[責任編輯 孔晶晶]