異丹葉大黃素在Caco—2細胞模型上轉運機制的研究

袁紫朔+張婷婷+金波+李彤+馬辰

[摘要]異丹葉大黃素具有抗炎、抗氧化、抗癌等藥理活性。該文研究了異丹葉大黃素在Caco-2細胞模型上的吸收轉運機制。采用UPLC法，應用PDA檢測器在310 nm處對異丹葉大黃素進行含量測定并計算表觀滲透系數P_app?？疾觳煌瑵舛犬惖と~大黃素在Caco-2細胞上的毒性以確定轉運實驗的給藥濃度。探討了時間、濃度、溫度、轉運體抑制劑對異丹葉大黃素在體外細胞模型上跨膜轉運的影響。實驗結果表明，異丹葉大黃素在10～60 μmol·L^-1，孵育14 h內，對Caco-2細胞沒有明顯毒性。異丹葉大黃素在Caco-2細胞模型上的轉運具有一定的濃度依賴性，其表觀滲透系數P_app大于10×10-6 cm·s^-1，易被Caco-2細胞吸收。 BL側的轉運量在3 h達到最大值，6 h有所下降。4 ℃條件下，P_app（AP-BL）與P_app（BL-AP） 均比37 ℃條件顯著減小。加入P-gp轉運體抑制劑維拉帕米后P_app（AP-BL）明顯增大；加入MRP轉運體抑制劑丙磺舒和MK-571后，P_app（BL-AP）明顯減小。研究結果提示，異丹葉大黃素在Caco-2細胞模型上的轉運方式主要是被動擴散，P-gp及MRP可能參與了異丹葉大黃素的外排轉運。

[關鍵詞]Caco-2細胞單層膜模型； 異丹葉大黃素； 轉運機制

[Abstract]Isorhapontigenin （ISO） is suggested to have many different kinds of pharmacology activities， such as anti-inflammatory effect， anti-oxidation effect and anti-cancer effect. This paper mainly discussed the transport mechanism of ISO in Caco-2 cell models. The concentration of ISO was determined by UPLC method with PDA detector at 310 nm， and then the apparent permeability coefficient P_app was calculated. The cytotoxic of different concentrations of ISO was investigated on Caco-2 cells to determine the concentration of drug administration. The effects of ISO concentration， time， temperature and transporter inhibitors on the transport of ISO were investigated. The test results showed that， ISO didn′t have significant cytotoxicity at 10-60 μmol·L^-1 in 14 hours. The transportation of ISO on Caco-2 cells was related to the concentration to a certain extent. P_app of ISO was higher than 10×10-6 cm·s^-1 and ISO was absorbed easily by Caco-2 cells. The transport volume of ISO at BL side reached maximum at 3 h and was slightly decreased at 6 h. P_app （AP-BL） and P_app（BL-AP） at 4 ℃ were lower than those at 37 ℃. P_app （AP-BL） of ISO was significantly increased after adding P-gp inhibitor verapamil and P_app （BL-AP） of ISO was significantly decreased after adding MRP-2 inhibitor （probenecid or MK-571）. The results suggested that transport mode of ISO was mainly passive diffusion in Caco-2 cell models， and P-gp and MRP may be involved in the transport of ISO.

[Key words]Caco-2 cell monolayer model； isorhapontigenin； transport mechanism

異丹葉大黃素（isorhapontigenin，ISO）存在于買麻藤類植物中，具有良好的抗炎^[1-2]，抗氧化^[3-5]，治療胰島素抵抗及肥胖^[6]等活性。近年來，有研究發現其有顯著的抗膀胱癌活性^[7-11]。有研究表明，小鼠灌胃不同濃度的異丹葉大黃素，采用LC-MS/MS測定其不同時間點的血藥濃度，發現異丹葉大黃素在小鼠體內迅速達峰，消除迅速，代謝較快^[9]。Caco-2細胞來源于人體結腸腺癌細胞，經培養分化后可形成與人體小腸上皮細胞一致的形態及功能，含有廣泛存在于人體小腸上皮細胞的藥物代謝酶及各種轉運體^[12]，可以用來研究藥物在體外吸收和代謝情況。該模型是目前應用最廣泛，最經典的用于研究藥物吸收轉運特性的體外模型。

本文應用Caco-2細胞模型對異丹葉大黃素的吸收轉運機制進行研究，探討藥物濃度、時間、溫度及轉運體抑制劑對其轉運的影響，為其后續開發提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters H-Class超高效液相色譜儀，Empower 3色譜管理站；Transwell（0.4 μm，PET膜， 美國Millipore公司）；細胞電阻儀（ERS-2，美國Millipore公司）；酶標儀（Synergy H1，美國BIOTEK公司）。

異丹葉大黃素購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；維拉帕米（消旋體），MK-571，丙磺舒，硫酸酯酶（Type H-2）均購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；α-MEM細胞培養液，標準胎牛血清，雙抗，胰蛋白酶（0.05%，0.02% EDTA），MTT（噻唑藍）均購自美國Gibco公司；其他化學試劑均為色譜純。

Caco-2細胞株購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，實驗所用細胞均在20～40代。

1.2 色譜條件

Waters BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～2 min，10%B，2～2.5 min，10%～35% B，2.5～6 min，35% B，6～6.5 min，35%～10% B，6.5～8 min，10% B，流速0.3 mL·min^-1；樣品室的溫度4 ℃；進樣體積10 μL；檢測波長310 nm。

1.3 樣品處理

所有經轉運實驗所得樣品溶液均先加入1倍體積的甲醇，然后置于4 ℃，15 000 r·min^-1離心15 min，取上清液進行異丹葉大黃素含量測定。

1.4 Caco-2細胞毒性實驗

1.4.1 DMSO細胞毒性 待細胞生長狀態良好時接種96孔板，接種密度為1×105個/mL，接種48 h后在培養液中加入DMSO，終濃度分別為 0.1%，0.3%，0.5%，1%，2%，3%，每個濃度設6個復孔，隨行空白組，孵育24 h后加入MTT溶液（0.5 g·L^-1），孵育4 h后每孔加入200 μL DMSO，充分溶解紫色結晶后，于570 nm波長處測量吸光度A，各組所得A分別與空白組A進行t檢驗，與空白組對比無顯著性差異的濃度為安全濃度。

1.4.2 異丹葉大黃素細胞毒性 待細胞生長狀態良好時接種96孔板，接種密度為1×105個/mL，接種48 h后在培養液中加入異丹葉大黃素，終濃度分別為10，20，30，40，50，60 μmol·L^-1，每個濃度設6個復孔，隨行空白組，孵育14 h后加入MTT溶液（0.5 g·L^-1），孵育4 h后每孔加入200 μL DMSO，充分溶解紫色結晶后，于570 nm波長處測量A，各組所得A分別與空白組A進行t檢驗，與空白組對比無顯著性差異的濃度視為在14 h內對Caco-2細胞無毒。

1.5 Caco-2細胞單層膜模型的建立

Caco-2細胞培養于37 ℃，含5%CO₂的環境中，采用α-MEM培養液，其中添加10%的標準胎牛血清和1%的雙抗。待細胞鋪滿培養瓶瓶底后，用0.05%的胰酶（含有0.02%的EDTA）消化，按1∶3傳代繼續培養，待細胞狀態良好時接種Transwell細胞培養板。采用PET膜的12孔Transwell細胞培養板，按上述消化方法接種Caco-2細胞，接種密度為2×105個/cm²。細胞絨毛面（Apical， AP側）加入400 μL培養液，細胞基底面（Basolateral， BL側）加入1 950 μL培養液。前14 d隔天換液，隨后7 d每天換液，經過標準化21 d培養后，應用電鏡及陽性質控藥對單層膜模型形態學，膜完整性及轉運功能進行驗證，并在實驗前用細胞電阻儀測量跨膜上皮細胞電阻（transepithelial electrical resistance， TEER），大于500 Ω×cm²的細胞單層膜可用于轉運實驗。轉運實驗前用Hank′s緩沖鹽溶液（Hank′s balanced salt solution， HBSS，pH=7.4，含有5 mmol·L^-1HEPES）清洗細胞單層膜3次。轉運實驗之后，需再次用細胞電阻儀測量TEER，TEER大于500 Ω×cm²的孔為實驗有效孔，數據可用，TEER小于500 Ω×cm²孔所得數據不可用。

1.6 異丹葉大黃素轉運實驗

1.6.1 異丹葉大黃素溶液的制備 精密稱取異丹葉大黃素適量，用DMSO溶解為20 mmol·L^-1的母液；4 ℃冷藏儲存。應用時用HBSS稀釋至目標濃度，過濾除菌（DMSO總含量不超過0.5%）。

1.6.2 數據處理 采用表觀滲透系數（apparent permeability coefficient，P_app）和滲透方向率（PDR）表示。

ΔQ為Δt內的轉運量，A為膜面積（1.12 cm²），C₀為初始給藥濃度。

由于每次取樣后需補加HBSS緩沖液，稀釋了藥物濃度，因此藥物的累積吸收濃度使用校正公式。

Ccum表示藥物累積濃度，A_N表示第n 個樣品通透濃度，V_N表示第n 個樣品的采樣體積，V 表示接受池的體積。

PDR=P_app（BL-AP）/P_app（AP-BL）

P_app（BL-AP）為藥物從BL側轉運到AP側的表觀滲透系數，P_app（AP-BL）為AP側轉運到BL側的表觀滲透系數。

數據采用SPSS 22.0軟件進行t檢驗分析。

每組數據為3次平行實驗平均值，用±s表示。

1.6.3 時間及濃度對異丹葉大黃素轉運的影響 根據1.4.2異丹葉大黃素細胞毒性實驗結果，分別取濃度為10，20，30，40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液各400 μL，加入AP側，作為供給池，取HBSS緩沖液1 950 μL加入BL側，作為接收池，置于轉速為35 r·min^-1的37 ℃恒溫搖床中，分別于1，3，6 h從BL側取出200 μL樣品溶液，同時補加200 μL空白HBSS。樣品溶液經處理后測定異丹葉大黃素的含量，并計算P_app。

1.6.4 溫度對異丹葉大黃素轉運的影響 取濃度為40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液400 μL，加入AP側，作為供給池，取HBSS緩沖液1 950 μL加入BL側，作為接收池，平行2份，一份放置于37 ℃恒溫搖床中，一份放置于4 ℃冰箱中，均孵育1 h。從接收池取200 μL樣品溶液，樣品溶液經處理后測定異丹葉大黃素的含量，并計算P_app及PDR。

1.6.5 轉運體抑制劑對異丹葉大黃素轉運的影響 分別從AP-BL，BL-AP 2個轉運方向考察異丹葉大黃素在Caco-2細胞模型中的轉運情況，同時考察轉運體抑制劑維拉帕米、丙磺舒、MK-571對異丹葉大黃素轉運的影響。

異丹葉大黃素組（40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液）；異丹葉大黃素+維拉帕米組（40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液配制含有200 μmol·L^-1維拉帕米的溶液）；異丹葉大黃素+丙磺舒組（40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液配制含有200 μmol·L^-1丙磺舒的溶液）；異丹葉大黃素+MK-571組（40 μmol·L^-1異丹葉大黃素溶液配制含有100 μmol·L^-1的MK-571溶液）。

AP-BL方向：AP側加入各組溶液400 μL作為供給池，BL側加入1 950 μL的空白HBSS緩沖液作為接收池，置于37 ℃，35 r·min^-1的恒溫搖床中孵育1 h。從接收池取200 μL樣品溶液，樣品溶液經處理后測定異丹葉大黃素的含量，并計算P_app。

BL-AP方向：BL側加入各組溶液1 950 μL作為供給池，AP側加入400 μL空白HBSS緩沖液作為接收池，置于37 ℃，35 r·min^-1的恒溫搖床中孵育1 h。從接收池取200 μL樣品溶液，樣品溶液經處理后測定異丹葉大黃素的含量，并計算P_app。

2 結果

2.1 UPLC含量測定方法學考察

將異丹葉大黃素用HBSS稀釋至0.2，1，5，10，50，100 μmol·L^-1，按照1.2項下條件進樣分析。待測物的峰面積為縱坐標Y，異丹葉大黃素濃度為橫坐標X，得到異丹葉大黃素的線性回歸方程為Y=43 649X+6 699.3，r=0.999 1，線性范圍0.2～100 μmol·L^-1。選擇低、中、高（5，10，40 μmol·L^-1）濃度的異丹葉大黃素溶液按照1.3項所示的樣品處理方法處理，分析并計算。結果表明，低、中、高濃度下樣品測定的回收率分別為90.92%，96.12%，98.03%；精密度分別為3.0%，1.7%，1.1%?？疾? μmol·L^-1異丹葉大黃素在不同溫度的穩定性，4 ℃ 4 h，RSD為0.46%，37 ℃ 7 h，RSD為7.8%，溶液穩定?？瞻兹軇┥V圖及異丹葉大黃素專屬性色譜圖（tR = 4.9 min）分別見圖1。實驗結果表明所建立方法符合生物樣品的定量要求。

2.2 Caco-2細胞毒性實驗結果

2.2.1 DMSO細胞毒性實驗結果 當DMSO濃度大于0.5%時，開始對細胞產生毒性，濃度越大毒性越大。因此，實驗所用的化合物溶液中DMSO濃度應小于0.5%，結果見圖2。

2.2.2 異丹葉大黃素細胞毒性實驗結果 當孵育時間為14 h，異丹葉大黃素濃度在10～60 μmol·L^-1時，其對細胞無明顯毒性。轉運實驗所選取的孵育時間及給藥濃度應參照此實驗結果，見圖3。

2.3 時間及濃度對異丹葉大黃素轉運的影響

隨著時間增加，透過Caco-2細胞單層膜的異丹葉大黃素的量逐漸增加，并在3 h達到最大值，在6 h有所下降，見圖4。在1 h轉運實驗中，異丹葉大黃素的P_app隨著濃度增加而增加，呈現出明顯的濃度依賴性，且P_app均大于10×10-6 cm·s^-1，屬于高滲化合物，見表1。

2.4 溫度對異丹葉大黃素轉運的影響

蛋白在低溫條件下活性減弱，因此Caco-2細胞膜上存在的各種轉運體在低溫條件下其功能會有所降低。4 ℃條件下所測得P_app（AP-BL）和P_app（BL-AP）均顯著小于37 ℃所測得的值，見表2。除此之外，37 ℃條件轉運結果計算的PDR為1.3，需用轉運體抑制劑來確定異丹葉大黃素是否為外排轉運的底物。

2.5 轉運體抑制劑對異丹葉大黃素轉運的影響

常見外排轉運體有P-糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥蛋白（MRP）等，分別加入P-gp抑制劑維拉帕米及MRP抑制劑丙磺舒和MK-571后，所測得的異丹葉大黃素的PDR均減小。加入維拉帕米后，異丹葉大黃素AP-BL轉運方向的P_app明顯增大，見表3；加入丙磺舒和MK-571后，異丹葉大黃素AP-BL轉運方向的P_app增大，BL-AP轉運方向的P_app明顯減小，分別見表4，5。

3 討論

應用Caco-2細胞單層膜模型對異丹葉大黃素轉運機制進行研究，能夠在體外細胞水平提供其通過小腸上皮細胞吸收和轉運的信息，用以推測其在人體腸道中的吸收和轉運特性。

異丹葉大黃素的P_app大于10×10-6 cm·s^-1，屬于高滲化合物。其吸收迅速，有濃度依賴性，P_app隨著給藥濃度增加而增大，表明異丹葉大黃素在Caco-2細胞模型中以被動擴散轉運為主。

當溫度降低到4 ℃時， AP-BL方向和BL-AP方向的跨膜過程都受到了明顯抑制，P_app均明顯下降。在4 ℃時，需要能量的主動轉運過程基本被抑制，結果提示異丹葉大黃素的跨膜過程有主動轉運的存在。

P-gp，MRP是Caco-2細胞中的主要轉運蛋白，其能發揮外排泵作用，將細胞內的化合物逆濃度梯度運至細胞外，其結果可能會導致藥物透膜吸收減少，生物利用度降低。加入P-gp和MRP抑制劑后，明顯降低其轉運的方向性。加入P-gp抑制劑維拉帕米后，異丹葉大黃素AP-BL轉運方向的P_app明顯增大，提示異丹葉大黃素可能為P-gp蛋白的底物。加入MRP抑制劑丙磺舒和MK-571后，異丹葉大黃素AP-BL方向的P_app有所增加，BL-AP轉運方向的P_app明顯減小，提示異丹葉大黃素可能為MRP的底物。P-gp和MRP可能參與了異丹葉大黃素的轉運過程。

異丹葉大黃素在Caco-2細胞模型上吸收具有時間依賴性，BL側異丹葉大黃素的量在3 h達到最大值，隨后有所下降。此現象與白藜蘆醇在Caco-2細胞模型上的轉運特征類似^[14]。此外，有文獻報道^[9]，小鼠灌胃異丹葉大黃素單體所得到的tmax為（0.14±0.05） h，t1/2為（1.72±0.27） h，MRT為0.70±0.20，提示異丹葉大黃素在體內吸收迅速且代謝廣泛，推測BL側異丹葉大黃素下降可能與其代謝迅速并被外排有關。

本實驗研究了異丹葉大黃素在 Caco-2 細胞上的吸收特征，包括時間、濃度、溫度及轉運蛋白對異丹葉大黃素轉運的影響。 結果表明，異丹葉大黃素在Caco-2細胞模型上吸收迅速，其轉運機制以濃度依賴性的被動擴散過程作用為主，同時P-gp，MRP等外排轉運體參與其轉運過程。推測異丹葉大黃素在人體腸道中可被迅速完全吸收，但因P-gp，MRP的外排作用，可能影響其口服生物利用度，限制其藥理活性及應用。

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[責任編輯 曹陽陽]