臨床用量的復方黃黛片及大劑量雄黃對大鼠肝臟主要藥物代謝酶的影響

徐煥華+汪美汐+譚洪玲+王宇光+湯響林+肖成榮+李樺+高月+馬增春

[摘要]探究臨床用量的復方黃黛片及大劑量君藥雄黃對大鼠肝臟主要藥物代謝酶（CYP450）酶活性的影響及在mRNA水平的調控作用。以Wistar大鼠為研究對象，受試藥物給予14 d后，采用Cocktail體外孵育法結合HPLC-MS/MS技術對大鼠肝中CYP1A2，CYP2B，CYP3A，CYP2C各亞酶的活性進行測定，并利用實時熒光定量PCR技術對上述亞型的mRNA水平表達進行檢測。結果顯示，復方黃黛片顯著誘導CYP1A2，CYP2B酶活性，抑制CYP3A酶活性，結果與mRNA的表達具有一致性，但其單味藥卻呈現出弱于其甚至是相反的現象；不同劑量的雄黃組之間對酶活性及mRNA的表達結果亦呈現非常顯著的不一致性。這些現象可能與復方黃黛片的配伍增效或減毒有關。CYP450酶的研究結果亦可以提示，復方黃黛片與其他藥物合用時有可能產生藥物相互作用。

[關鍵詞]復方黃黛片； 雄黃； 細胞色素P450； 肝微粒體； 酶活性

[Abstract]To investigate the effect of clinical dose of Realgar-Indigo Naturais formula （RIF） and large-dose of Realgar on main drug-metabolizing enzymes CYP450s of rat liver， as well as its regulatory effect on mRNA expression. Wistar rats were administrated orally with tested drugs for 14 days. A Cocktail method combined with HPLC-MS/MS was used in the determination of 4 cytochrome P450 isozymes （CYP1A2， CYP2B， CYP3A and CYP2C） in liver of the rats， and the mRNA expression levels of the above subtypes were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The results showed that RIF can significantly induce CYP1A2 and CYP2B enzyme activity， and inhibit CYP3A enzyme activity. This result was consistent with the mRNA expression. However， its single compound showed weaker or even contrary phenomenon. Different doses of Realgar also showed significant inconsistencies on CYP450 enzymes activity and mRNA expression. These phenomena may be relevant with RIF compatibility synergies or toxicity reduction. The results can also prompt drug interactions when RIF is combined with other medicines in application.

[Key words]Realgar-Indigo Naturalis formula； realgar； cytochrome P450； liver microsome； enzyme activity

細胞色素P450（cytochrome P450， CYP450）氧化酶系統是參與機體絕大多數藥物、外源性物質和內源性物質進行Ⅰ相氧化代謝的主要酶類^[1-2]，臨床使用的藥物有90%以上由其代謝^[3]。因此，該酶在藥物代謝以及藥物相互作用的研究中有著重要地位。近年來，由于中藥應用推廣呈現良好態勢，而藥源性損害事件也屢有報道^[4]，因此，基于P450酶系統的中藥與其活性成分以及組分配伍的安全性和療效研究具有十分重要的意義 [5-7]。對確有療效的有毒中藥的相關研究更為重要。

含砷制劑（雄黃、砒霜）在臨床治療急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia， APL）時表現出較好的療效^[8-9]，復方黃黛片（RIF）就是含砷制劑的主要代表藥物。其由國醫大師黃世林發明，由雄黃、青黛、丹參和太子參組成，臨床主治為清熱解毒，益氣生血，用于初治的APL，療效顯著。復方黃黛片中君藥雄黃作為確有療效的有毒中藥，尤為受到關注。目前對復方黃黛片的研究大多聚焦于臨床及藥理作用的分子機制，因此，本實驗針對CYP450酶系統，通過觀察給藥后大鼠體重、血液指標、CYP各亞酶酶活性水平及mRNA轉錄水平等的變化，初步探究臨床用量的復方黃黛片與其各組分以及大劑量君藥雄黃對大鼠肝臟主要藥物代謝酶的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑

復方黃黛片（每片含水飛雄黃39.2 mg，青黛90.4 mg，丹參108.0 mg，太子參32.4 mg，硬脂酸鎂2.7 mg）由安徽省天康藥業有限公司生產，生產批號150402；水飛雄黃購于北京華邈中藥工程技術開發中心，由軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所馬百平研究員鑒定；青黛、丹參、太子參均購自北京同仁堂藥業股份有限公司；CYP同工酶CYP1A2，CYP2B6，CYP3A4，CYP2C9的特異性底物以及相應代謝產物的標準物質非那西丁/對乙酰氨基酚（phenacetin/acetaminophen）、安非他酮/羥基安非他酮（bupropion/hydroxybupropion）、咪達唑侖/1′-羥基咪達唑侖（midazolam/1′-hydroxymidazolam）、甲苯磺丁脲/4-羥基甲苯磺丁脲（tolbutamide/4-hydroxytolbutamide）來源于USP標準物質或Sigma公司；NAPDH購于Roche公司；鹽酸普萘洛爾標準物質購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈均為色譜級，購于Fisher公司；Ultra RNA提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購于CWBIO公司；逆轉錄、聚合酶鏈式反應試劑盒為TransScript公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.2 分組及給藥

雄性Wistar大鼠（SPF級），體重（200±10） g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK（軍）-2012-0004。大鼠給予標準飼料和水，飼養于軍事醫學科學院27號院動物實驗室，12 h日夜節律。飼養3 d后利用SAS隨機分組程序根據體重隨機分為正常對照組（NC組）、苯巴比妥組（PB組）、復方黃黛片組（RIF組）、雄黃臨床用量組（RCD組）、雄黃大劑量組（RLD組，為雄黃臨床用量的20倍）、青黛臨床用量組（QD組）、丹參臨床用量組（DS組）、太子參臨床用量組（TZS組），每組8只。各實驗組劑量依據復方黃黛片臨床使用劑量設置，并折算成大鼠的等效劑量。其中NC組灌胃純凈水；PB組于實驗結束前3 d連續腹腔注射給予苯巴比妥溶液，劑量為80 mg·kg^-1·d^-1；RCD組（104.4 mg·kg^-1·d^-1）、RLD組（2 088.0 mg·kg^-1·d^-1）、QD組（241.2 mg·kg^-1·d^-1） 3個組別的藥材水飛雄黃和青黛成品均為超細粉，按照上述劑量計算，直接稱取藥材粉末適量，配制成所需濃度的混懸液即可；RIF組（720.0 mg·kg^-1·d^-1）和TZS組（86.4 mg·kg^-1·d^-1）的藥物分別粉碎后研成細粉，過100目篩后加純凈水制成混懸液；DS組（288.0 mg·kg^-1·d^-1）供試液制備方法為：精密稱取丹參，加10倍量純凈水，煎煮4次，每次2 h，濾液合并，52 ℃減壓濃縮至所需濃度。灌胃給藥（5 mL·kg^-1），連續14 d，于第15天處死動物，采血用于血液分析和血清生化分析，取肝臟并制備肝微粒體。

2 方法

2.1 動物體重

于分組時、給藥前、給藥第7天和解剖前分別稱量各組動物體重。

2.2 血象和血清生化指標檢測

采用Sysmex 2000i型血細胞分析儀檢測大鼠常規血象，另采用日立7180型生化分析儀分析丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、總膽紅素（TBIL）、肌酐（CREA）等生化指標。

2.3 cocktail 探針法測定各實驗組對大鼠肝臟CYP450酶活性水平的影響

2.3.1 肝微粒體的制備 肝微粒體的制備采用差速離心法^[10]。大鼠禁食不禁水12 h，頸椎脫臼處死，迅速剪開腹腔，腹腔靜脈采血，結扎上腔靜脈，用4 ℃生理鹽水由門靜脈灌洗至肝臟呈土黃色。將肝臟剪碎，按1∶4加入TMS緩沖液（Tris-base 12.11 g，MgCl₂·6H₂O 1.21 g，蔗糖137 g，溶于2 L超純水中，濃鹽酸調節pH至7.5，儲存于4 ℃備用），冰浴中勻漿，勻漿液于4 ℃，12 000×g離心20 min，棄沉淀，留上清。上清液于4 ℃，105 000×g離心60 min，棄上清，沉淀部分即為所需的肝微粒體。按初始勻漿時每克肝組織加入1 mL Tris-HCl儲存液（Tris-base 12.12 g，EDTA-2Na 0.37 g，加入蒸餾水800 mL，濃鹽酸調節pH為7.5，加入200 mL甘油混合均勻，儲存于4 ℃備用），重懸微粒體，冰浴，玻璃勻漿管手動勻漿，使肝微粒體分散均勻，分裝于凍存管中，-80 ℃保存。微粒體蛋白濃度采用BCA法定量，定量方法參照BCA蛋白定量試劑盒。

2.3.2 肝微粒體孵育體系 同時檢測4種主要的CYP450亞型（CYP1A2，CYP2B6，CYP3A4，CYP2C9）活性變化。孵育體系總體積200 μL，其中肝微粒體蛋白總質量濃度為0.5 g·L^-1，NADPH終濃度為1 mol·L^-1，CYP450特異性探針藥物濃度依次為非那西?。?0 μmol·L^-1）、安非他酮（25 μmol·L^-1）、甲苯磺丁脲（25 μmol·L^-1）、咪達唑侖（2.5 μmol·L^-1），不足部分以K₂HPO4/KH₂PO4緩沖液（0.05 mol·L^-1，pH 7.4）補足體系至200 μL。在37 ℃水浴中預孵育5 min，加入同時預孵育5 min的NAPDH啟動反應，繼續孵育30 min。孵育完成后加入冰冷的由甲醇-乙腈（1∶1）配制的含內標鹽酸普萘洛爾800 μg·L^-1的終止劑溶液200 μL停止反應，渦旋1 min，13 000×g，4 ℃離心20 min，取上清液進樣檢測，測得酶活性。

2.3.3 代謝產物HPLC-MS/MS檢測條件^{[11] 色譜條件：流動相A（含0.1%甲酸和5 mmol·L-1甲酸銨的純水），流動相B（含0.1%甲酸的乙腈），梯度洗脫，0～1.5 min，30%B，1.5～3.5 min，30%～95%B，3.5～3.6 min，95%～30%B，3.6～4.5 min，30%B，流速0.45 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣體積10 μL。}

質譜條件：以電噴霧電離離子源（ESI源），采用質譜多級反應檢測（multiple reaction monitoring， MRM）方式檢測，毛細管電壓4 000 V，毛細管溫度320 ℃，霧化電壓25 psi（1 psi=6.895 kPa），干燥氣流速10 L·min^-1，其他質譜分析參數見表1。

2.4 熒光定量PCR技術測定各受試物對大鼠肝臟CYP450酶mRNA水平的影響

2.4.1 肝組織總RNA的提取 大鼠處死后迅速取出肝臟，至于液氮中預凍，-80 ℃保存。按CWBIO公司Ultra RNA提取試劑盒說明書提取肝臟總RNA。電泳分析表明18S和28S條帶清晰可見，A260/A280在1.8～2.0，總RNA片段完整未降解，可用。

2.4.2 逆轉錄（RT）反應 RNA上樣量為1 μg，依據測得的RNA濃度計算加入的體積，另加入2×TS Reaction Mix 10 μL，RT/RI Enzyme Mix 1 μL，Anchored Oligo（dT）₁₈ 1 μL，RNase-free Water補足反應體系至20 μL，混勻。逆轉錄條件為42 ℃，30 min，85 ℃，5 min，逆轉錄產物-20 ℃保存待用。

2.4.3 實時定量PCR（RT-qPCR）反應測定mRNA表達水平 RT-qPCR反應依據TransScript公司qPCR試劑盒說明書進行，反應總體系20 μL，分別為：逆轉錄產物cDNA 2 μL，2×TransStart Green qPCR SuperMix 10 μL，Forward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，Passive Reference Dye 0.4 μL，ddH₂O 6.8 μL。RT-qPCR反應條件為：94 ℃，30 s，94 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循環40次，以GAPDH作為內參基因。mRNA表達水平用比較閾值法進行定量分析，所擴增的目的基因誘導或抑制的倍數=2-ΔΔCt，即RQ。單次試驗平行3個復孔，實驗重復3次。特異性引物序列見表2。

2.5 數據統計

數據用±s表示，采用SAS 8.1軟件兩因素析因設計的方差分析進行組間比較，采用Graphpad prism軟件作圖。

3 結果

3.1 對大鼠體重的影響

分組時和給藥前各實驗組動物體重一致，與正常對照組比較均無統計學差異；給藥第7天時，與正常對照組相比，雄黃大劑量組體重偏小非常顯著（P<0.01），太子參組體重增加，且有統計學意義（P<0.05）；解剖前，除雄黃大劑量組體重偏小非常顯著（P<0.01），其余各實驗組與正常對照組比較均無統計學差異，結果見表3。

3.2 對血象和血清生化指標的影響

對血象數據進行分析，與正常對照組比較，其余各實驗組血象均無明顯改變，其值均在大鼠血象正常參考范圍內；對血清生化指標進行分析，結果顯示，雄黃大劑量組表征肝臟功能的3個指標ALT，AST，ALP較正常對照組均有升高，P分別為0.07，0.07，0.03，雄黃臨床用量組ALP與正常對照組比較顯著升高，提示雄黃對肝臟功能可能存在潛在影響，后續相同劑量相同給藥時間的另一批試驗中，對主要臟器的組織病理學進行檢查，發現雄黃大劑量組肝臟細胞出現輕微的細胞變性，其余主要臟器未見明顯改變，結果見表4。

3.3 復方黃黛片和大劑量雄黃對大鼠肝微粒體CYP450酶活性的影響

結果顯示臨床用量的復方黃黛片及大劑量雄黃連續給藥14 d后，與正常對照組比較，復方黃黛片組和大劑量雄黃組均能顯著誘導CYP1A2酶活性（P<0.05），而雄黃臨床用量對酶活性沒有顯著影響，丹參組非常顯著的抑制了CYP1A2酶活性（P<0.01）；復方黃黛片組，雄黃大劑量組，青黛組和丹參組均能顯著誘導CYP2B的酶活性（P<0.05），但臨床用量的雄黃組及太子參組對CYP2B酶的活性具有非常顯著的抑制作用（P<0.01）；對于CYP3A的酶活性，除臨床用量的雄黃組于正常對照組比較無差異外，其余各實驗組均具有非常顯著的抑制CYP3A酶活性的作用（P<0.01）；復方黃黛片組對CYP2C的酶活性無顯著的誘導作用，大劑量雄黃組對CYP2C的酶活性具有非常顯著的誘導作用（P<0.01），結果見表5。

3.4 對CYP450酶各亞型mRNA表達的影響

結果顯示：PB組作為陽性對照組可顯著誘導各亞型mRNA的表達（P<0.01），與NC組比較，對于CYP1A2來說，各實驗組均顯著誘導CYP1A2 mRNA的表達（P<0.01），其中RIF組與RLD組誘導作用最為顯著，是RCD組的3.1倍；對于CYP2B1/2來說，RIF組、RLD組、QD組和DS組對CYP2B1/2 mRNA的表達有非常顯著的誘導作用，RCD組和TZS組對CYP2B1/2 mRNA的表達無明顯誘導作用；對于CYP2C11來說，RLD組能顯著誘導CYP2C11 mRNA的表達（P<0.01），RIF組和QD組對CYP2C11 mRNA的表達無明顯誘導作用，RCD組、DS組和TZS組對CYP2C11 mRNA的表達有顯著抑制作用（P<0.01），對于CYP3A1來說，各實驗組對CYP3A1 mRNA的表達均有非常顯著的抑制作用（P<0.01），雄黃大劑量組的抑制作用最為明顯，結果見圖1。

4 討論

在急性早幼粒細胞白血病的治療中，復方黃黛片經常作為主藥與全反式維甲酸、地西他濱、沙利度胺、維A酸等諸多藥物合用^[12-13]，由此可能產生的潛在藥物相互作用不容忽視，本實驗對CYP450酶的研究結果能在一定程度上對復方黃黛片與其他藥物合用時有可能產生的藥物相互作用提供啟示。

在人體眾多CYP亞型中，CYP1A2，CYP2C9，CYP2B，CYP3A4 4種亞型占到由P450酶介導的藥物代謝的80%^[14-15]。在本研究中，選擇大鼠作為實驗對象，盡管其和人類在CYP450酶的亞型種類，表達和催化活性上確實存在差異，但是其依然作為一種被推薦使用的動物模型用于預測藥物在人體內的代謝行為。且理論上說，人體CYP亞型CYP1A2，CYP2C9，CYP2B6，CYP3A4與鼠CYP亞型CYP1A2，

CYP2C11，CYP2B1/2，CYP3A1相對應具有同源性^[2]。與此同時，上述幾種亞型在嚙齒類動物的外源性物質活化與減毒過程中也扮演十分重要的角色。因此選擇大鼠作為實驗對象是合理的。

復方黃黛片對CYP1A2和CYP2B1/2 mRNA的表達均有顯著誘導作用，與此同時，復方中的單味藥卻表現出弱于復方的誘導作用甚至抑制作用；對CYP2C11 mRNA的表達無誘導作用，但雄黃（臨床用量）組、丹參組和太子參組卻受到顯著抑制；在CYP3A1 mRNA的表達上，各實驗組均受到不同程度的顯著抑制。大劑量雄黃組對CYP1A2，2B1/2，2C11 mRNA的表達有顯著的誘導作用，對CYP3A1的表達有顯著抑制作用，且抑制程度均高于其他實驗組。已檢測的酶活性數據也印證了上述結果。上述多個現象表明，復方黃黛片及其方中各組分對4種CYP酶mRNA的表達存在顯著的不一致，這種不一致性可能是由方中各組分的協同或拮抗作用產生的。而且這一作用可能在轉錄環節就已經開始，并影響到酶活性。

基于CYP450酶的藥物相互作用與中藥組分配伍之間的毒效關系有著緊密聯系，課題組前期用現代藥理學方法證實了甘草“調和諸藥”的科學內涵^[7]，課題組發現甘草及其主要成分甘草酸對CYP3A均能產生明顯的誘導作用，且確證了甘草效應成分通過與PXR受體結合，繼而誘導CYP3A酶活性而加速了方劑中其他配伍中藥有效成分的代謝而起到調節諸藥，甚至是解毒的作用。本研究中，復方及單組分對CYP450酶活性及mRNA表達影響的不一致性，或許能從CYP450酶的角度揭示復方黃黛片組方的科學內涵。但這還有待下一步的深入研究。

為進一步研究君藥雄黃對CYP450酶的影響，本實驗設計了雄黃大劑量給藥組。梁愛華^[16]和陸遠富^[17]的研究均表明，科學評價雄黃的毒性，其劑量設置的合理范圍應當在10～16倍。綜合考慮，為避免在14 d給藥期間出現過度不良反應，又期望能看到對大鼠的輕微損害，結合預實驗結果，選擇臨床用量的20倍作為雄黃的大劑量組。結果顯示，雄黃大劑量組大鼠體重增長速度明顯低于其余實驗組，且ALT，AST，ALP等指標均有明顯改變。后續實驗證實，此時已經有輕微的肝損害發生?；诖饲疤?，分析雄黃大劑量組對CYP450酶活性及mRNA表達的影響，結果表明雄黃大劑量組與臨床用量的雄黃組表現出顯著差異，提示雄黃對CYP450酶的影響可能與劑量相關，且雄黃大劑量組在CYP3A酶活性和mRNA表達水平上均顯著低于雄黃臨床用量組，而CYP3A是藥物代謝中最為重要的酶亞型，臨床上60%的藥物需經CYP3A代謝排出體外^[18]，雄黃大劑量組出現肝臟細胞輕微變性，肝功能生化指標的改變可能與CYP3A酶活性受到抑制導致雄黃不能順利排出體外而引起蓄積毒性有關。在本研究中，未設置線性劑量的雄黃組也是實驗的不足之處，但本實驗仍然為下一步的深入研究提供了可靠線索。且在后續研究中已經證實，雄黃隨著劑量增大，對CYP3A酶的活性抑制增強，且具有線性相關，對其余3種CYP450酶活性其結果未呈現線性相關。相關實驗結果已另文發表。

[參考文獻]

[1]Chen X M， Wei M， Zhang H M， et al. Effect of vanillin and ethyl vanillin on cytochrome P450 activity in vitro and in vivo[J].Food Chem Toxicol，2012，50（6）：1897.

[2]Han Y L， Li D， Ren B， et al. Evaluation of impact of Herba Erigerontis injection， a Chinese herbal prescription， on rat hepatic cytochrome P450 enzymes by cocktail probe drugs[J].J Ethnopharmacol，2012，139：104.

[3]Badal S， Williams S A， Huang G， et al. Cytochrome P450 1 enzyme inhibition and anticancer potential of chromene amides from Amyris plumieri[J].Fitoterapia，2011，82（2）：230.

[4]童瑞敏.何首烏及其制劑致藥物性肝損傷20例分析[J].山東中醫雜志，2015，34（12）：928.

[5]Wang Y G， Zhou J M， Ma Z C， et al. Pregnane X receptor mediated-transcription regulation of CYP3A by glycyrrhizin： a possible mechanism for its hepatoprotective property against lithocholic acid-induced injury[J]. Chem Biol Interact，2012，200（1）：11.

[6]趙春，李銀生，蔣美琳，等.細胞色素P450與外源物的相互作用研究進展[J].中國現代應用藥學，2014，31（8）：1020.

[7]高月.基于藥物代謝酶的中藥毒性與毒理研究[J].毒理學雜志，2005，19（3）：175.

[8]Torka P， Al Ustwani O， Wetzler M， et al. Swallowing a bitter pill-oral arsenic trioxide for acute promyelocytic leukemia[J].Blood Rev，2016，30（3）：201.

[9]孫峰，陳楠楠，成玉斌.復方黃黛片治療急性早幼粒細胞白血病204例經驗總結[J].中西醫結合學報，2008，6（6）：639.

[10]許龍龍，湯響林，馬增春，等.決明子水提液對大鼠肝臟CYP450酶的影響[J].中國中藥雜志，2016，41（8）：1504.

[11]梁淼.基于P450酶的四物湯配伍規律研究[D].南寧：廣西醫科大學，2014.

[12]韋惠琴，鐘衛一.復方黃黛片聯合全反式維甲酸治療初發急性早幼粒細胞白血病的療效[J].中國醫藥導刊，2013，15（11）：1864.

[13]謝瑋，龐纓，葉絮，等.復方黃黛片聯合沙利度胺治療難治或復發多發性骨髓瘤臨床觀察[J].廣州醫科大學學報，2015，43（5）：28.

[14]Ingelman-Sundberg M. Pharmacogenetics of cytochrome P450 and its applications in drug therapy： the past， present and future[J].Trends Pharmacol Sci，2004，25（19）：193.

[15]Lewis D F. P450 structures and oxidative metabolism of xenobiotics[J].Pharmacogenomics，2003，4（4）：387.

[16]梁愛華，李春英，王金華，等.雄黃的毒性研究[J].中國中藥雜志，2011，36（12）：1889.

[17]陸遠富，時京珍，石京山，等.科學評價含雄黃、朱砂中成藥的安全性[J].中國中藥雜志，2011，36（24）：3402.

[18]徐芝秀，石秀英，金科濤，等.甘草與海藻提取液合用對CYP3A1/2酶活性及mRNA表達的影響[J].中國藥師，2007，10（6）：515.

[責任編輯 曹陽陽]