不同培養基對皮膚來源的成纖維細胞增殖、衰老及膠原蛋白分泌的影響

喇文軍，林孝發，蔣 偉，王 妍，尹衛民，林嘉歡，林 峰

不同培養基對皮膚來源的成纖維細胞增殖、衰老及膠原蛋白分泌的影響

喇文軍1，林孝發1，蔣 偉1，王 妍1，尹衛民2，林嘉歡1，林 峰1

（1.深圳職業技術學院應用化學與生物技術學院 廣東 深圳 518055；2．深圳市君焯醫療美容整形研究所廣東 深圳 518040）

目的：探討不同培養基組成對皮膚成纖維細胞的增殖、衰老及膠原蛋白分泌的影響。方法：采用兩步酶消化法從健康人耳后皮膚中獲得成纖維細胞，依據培養基種類不同分為A組（FM無血清培養基）、B組（DMEM+10%FBS）、C組（RPMI-1640+10%FBS）、D組（DMEM+F12(1∶1)+10%FBS），采用MTT法、細胞劃痕實驗、酶聯免疫吸附實驗、β-半乳糖苷酶試驗、軟瓊脂克隆形成試驗比較不同培養基對細胞增殖、遷移、膠原分泌、老化、變異的影響。結果：采用酶消化法在2d～4d內即可從組織塊中獲得大量成纖維細胞；其中B、D組較A、C組細胞增殖較快，且趨勢與MTT細胞增殖相同；劃痕實驗顯示B、D組較A、C組向缺損部位遷移更為明顯；此外，D組膠原蛋白分泌量高于其余三組（P＜0.05），且連續傳代30次后，細胞無明顯衰老及瘤變跡象。結論：兩步酶消化法可快速高效的從人組織塊中獲得成纖維細胞，且采用DMEM+F12(1∶1)完全培養基有利于促進細胞增殖、分泌膠原蛋白及延緩細胞衰老。

成纖維細胞；培養基；膠原蛋白；細胞增殖；原代培養

醫療技術的發展及人們生活水平的提高，使人類平均壽命得到有效延長的同時，也使延緩衰老漸漸進入人類視野。而皮膚作為人體最大的器官，其結構完整、美觀不僅影響著心情，也體現其生活質量的高低。因此，越來越多的愛美人士渴望通過醫療技術干預皮膚老化。然而，目前市場主流的抗衰老產品多以化學藥物或激光療法為主，其短期效果明顯，但長期效果及安全性卻一直備受質疑[1-2]。自體細胞回輸技術，其采用體外培養自體成纖維細胞達一定數目及活性后，將其回輸入人體執行特定皮膚部位老化細胞的功能，從而對延緩皮膚衰老起到促進作用，具有更高的安全性及有效性[3]。然而，如何快速獲得活性細胞在一定程度上制約了自體細胞回輸技術的臨床應用。因此，本研究對耳后皮膚中成纖維細胞進行提取，傳代，通過研究不同培養基對成細胞細胞增殖、膠原分泌以及細胞傳代中的穩定性進行分析，以期為該技術的推廣應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料：①正常耳后皮膚組織由深圳市君焯醫療美容整形研究所提供；A549肺癌細胞由深圳市大規模細胞培養技術和細胞資源庫公共技術服務平臺提供；②0.25%胰酶，II型膠原酶、人膠原酶I型酶聯免疫分析試劑盒購自sigma公司；MTT試劑盒、β-半乳糖苷酶購自碧云天公司；FM無血清培養基購自sciencell公司；Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養基、Roswell Park Memorial Institute-1640（RPMI-1640）培養基、Nutrient Mixture F-12（F12）培養基、胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 分組：A組FM無血清培養基，B組DMEM+10%FBS，C組RPMI-1640+10%FBS, D組DMEM+F12(1:1)+10%FBS；

1.2.2 成纖維細胞原代培養：無菌條件下取正常耳后皮膚約2cm×3cm，將其放入無菌PBS中迅速帶回實驗室，去掉皮下組織及血管，按體積質量比5∶1加入消化液I（0.25%胰酶+0.02EDTA）,4℃過夜處理。第二日取出皮膚，去掉表皮，按體積質量比10∶1加入消化液2（1mg/ml II型膠原酶），37℃，2h處理。將上述混懸液過200目篩網，吹打濾過液，并將其等分成4份進行離心 500r/min，10min，補加相應培養基重懸后，加到T25細胞培養瓶中，37℃ 5%CO2過夜培養，并鏡下觀察細胞是否呈現放射狀或漩渦狀生長。

1.2.3 細胞增殖實驗：單層成纖維細胞經消化液1消化后，依據分組情況，加入相應培養基稀釋細胞密度至約5×103個/ml，以100μl/孔接種于6塊96孔板中，每組12個孔，且96孔板外圍不設實驗孔。隨后將6塊96孔板放入37℃ 5%CO2培養箱中培養，并在12h、24h、48h、72h、96h、120h時間點取一塊96孔板棄去培養液，加入MTT（50μl/孔），37℃、5%CO2培養4h，緩慢吸取培養液并用清水沿孔壁吸取未反應的MTT，濾紙拍干，隨后加入DMSO（150μl/孔），室溫振蕩10min，在波長490nm下讀取各孔吸光度值，并計算各組吸光度平均值。

1.2.4 細胞劃痕實驗：將四種培養基培養的成纖維細胞，按2×105cell/孔，接種至6孔板中，37℃、5%CO2培養過夜至細胞鋪滿六孔板，采用無菌槍頭在六孔板底部人為劃出幾道橫，PBS清洗3次后，加入相應培養基，每隔2h在同一部位拍照觀察細胞遷徙情況。

1.2.5 膠原酶分泌：將各組細胞轉移至T25細胞培養瓶中培養，每次傳代前，吸取細胞上清液-20℃凍存，PBS清洗一次，加入消化酶1消化3min，離心，取出消化酶1,加入培養基重懸，吸取一半補加入原瓶37℃、5%CO2繼續培養，共收集各組在傳代前、傳代1次、傳代2次、傳代3次、傳代4次上清液，離心3 000r/min,10min，將樣品存于-20℃冰箱備用，并按照試劑盒說明書進行人膠原蛋白酶I酶聯免疫試驗。

1.2.6 細胞衰老：采用β-半乳糖苷酶檢測試劑盒，大致步驟如下：將細胞傳代按5×104cell/孔接種至6孔板中，PBS清洗，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室溫放置15min，吸棄固定液，PBS清洗3次，3min/次，加入1ml染色液放置于不含CO237℃培養箱中孵育過夜，隔日顯微鏡下觀察細胞染色情況。

1.2.7 軟瓊脂克隆形成實驗：配置2X DMEM-F12完全培養基（含2X FBS），并與等體積1.2%低熔點瓊脂混合加入6孔板中，每孔1.6ml，常溫放置待其凝固。將傳代30次的成纖維細胞經胰酶消化、離心，添加2X完全培養基稀釋細胞濃度至1×105cell/ml；另將2X DMEM-F12完全培養基與等體積0.7%低熔點瓊脂糖混合后，并加入100μl細胞懸液混勻，添加至含有下層凝固的瓊脂完全培養基中，放入37℃、5%CO2培養箱10d～14d后，每孔加入1ml(0.01%)結晶紫，室溫染色10min，拍照計數。其中，本實驗以A549肺癌細胞作為陽性對照。

1.3 統計學分析：采用SPSS19.0統計分析軟件，對其中計量資料以（xˉ±s）表示，并進行重復資料方差分析或成組t檢驗。當P＜0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞原代培養：皮膚組織經消化液1及消化液2處理后，各組均在37℃，5%CO2培養條件下培養。其中B、D組在培養72h后均可見大量成纖維細胞及少量上皮樣細胞（見圖1A），依據兩種細胞對消化酶I耐受度不同，通過3次傳代后，視野下即無上皮樣細胞（見圖1B）。而A、C組則需培養96h以上才可達到細胞融合度80%以上并進行傳代。

2.2 MTT實驗結果：其結果顯示，培養24h后，四組細胞均開始增殖。其中B組、D組細胞在培養48～72h細胞增殖最快，而A、C組在72～96h增殖快。經統計分析，四組在培養72h后，OD值差異存在統計學意義（F=14.353,P=0.034）（見圖2）。

2.3 細胞劃痕實驗：自細胞劃痕后24h內，每隔2h對細胞遷徙情況進行拍照，其結果顯示，當采用D組培養液細胞遷移速度明顯快于其余各組。見圖3。

2.4 膠原蛋白檢測：各組均先扣除傳代前膠原蛋白含量，其中A組細胞分泌膠原含量相對穩定，而B、D組在傳代3次后膠原分泌達到最大后膠原分泌量逐漸減少，見表1。

圖1 細胞原代培養結果

圖2 各組細胞MTT實驗結果

表1 各組細胞膠原蛋白分泌檢測 （xˉ±s）

2.5 β-半乳糖苷酶：自細胞傳代至38代時，對四組細胞分別進行β-半乳糖苷酶檢測，其中B組細胞衰老明顯，而C組次之，A、B組較不明顯。見圖4。

2.6 軟瓊脂克隆形成實驗：以A549肺癌細胞為陽性對照品，其結果顯示，皮膚成纖維細胞在體外培養30代后，接種在軟瓊脂上培養15d后，不形成克隆且細胞均死亡，見圖5。

3 討論

衰老是人類生命歷程中不可缺少的環節，且往往從一個細胞群的老化為起點。而成纖維細胞作為是皮膚中重要的細胞之一，其不僅能合成及分泌膠原蛋白來維持皮膚彈性及韌性，同時也可在皮膚受到損傷時，參與組織修復。而目前研究證實，成纖維細胞活性減弱，膠原蛋白分泌量減少是皺紋產生的重要因素[4]。目前抗皺化妝品種多含有人表皮神經生長因子，堿性成纖維細胞生長因子等，這類生長因子也主要作用于成纖維細胞[5]。此外，針對皮膚性疾病或燒傷等意外引起的皮膚缺損，單靠自體皮膚移植已不能滿足臨床應用需求，若能在短時間內，通過體外培育出大量的人表皮成纖維細胞或將為臨床應用提供新的思路。由此可見，表皮成纖維細胞的培養具有極高的臨床應用價值。

圖3 細胞遷移實驗

圖4 各組細胞衰老實驗

圖5 軟瓊脂克隆形成實驗

針對以往研究中多采用包皮組織作為實驗用皮膚，雖其具有取材方便的優點，但皮膚來源均為男性，在實際應用中并不能廣泛代表所有人群皮樣特點。而鑒于大多數人群的耳后皮膚在實際生活中均較少受到摩擦，皮膚細胞更替慢，其個體間差異較小，從而能更具有廣泛性結果。因此，本研究特以人耳后皮膚作為實驗用組織。另外，本研究采用酶消化法替代植塊法。對于0.5cm×0.5cm皮膚塊，經酶消化后24h即可見成纖維細胞貼壁，消化后72～96h可見大量成纖維細胞貼壁，不僅保證的細胞數目及細胞正常形態，同時減少細胞增殖次數，縮短實驗周期。而朱靜、叢敬[6-7]等采用植塊法，不僅操作步驟繁瑣如及時翻轉細胞培養瓶等，且細胞需培養14d以上才可順利進行傳代，且遠離組織塊處細胞已明顯變大、老化，使得獲得細胞質量及數量均不如酶消化法。陳甫寰、趙洪良[8-9]等采用酶消化法處理人皮膚組織，其獲得的目的細胞時間大大縮短。此外，針對酶消化法中的殘留的表皮細胞，根據文獻報道[10]，表皮細胞較成纖維細胞更加耐受胰酶，但貼壁速度慢，因此采用快速酶消化，早期替換培養液的方法可獲得高純度的成纖維細胞。

雖然采用酶消化法可在短時間內獲得大量成纖維細胞，但成纖維細胞是否也有自身偏愛的營養成分？我們發現，采用DMEM+F12培養基可有效促進細胞的增殖，采用RPMI-1640培養基時，細胞增殖速度相對緩慢，而MTT實驗進一步證實了，即使是相同細胞密度下，DMEM及DMEM+F12對于細胞的促增殖作用也明顯高于RPMI-1640及FM無血清培養基。如以往文獻報道[11]，貼壁類細胞采用DMEM培養時可獲得較快生長速度，其高濃度的細胞增殖成分使得剛分離的成纖維細胞可快速適應體外培養環境。此外，考慮臨床應用細胞的部位多為受損或老化部位，因此本文通過人為創造創面，來模擬細胞在注射入人體內后的遷移情況。其結果顯示，成纖維細胞填充創面速度為：DMEM+F12≥DMEM＞FM＞RPMI-1640。但對細胞形態進行觀察發現，DMEM細胞形態變大，而DMEM+F12仍保持原有細胞形態。由于細胞衰老時多出現細胞核增大現象，以便利于細胞吸收更多物質。而衰老細胞在分泌膠原蛋白、纖維粘連蛋白、彈性蛋白等細胞外基質能力明顯減弱，而這類物質不僅對細胞起到支撐、連接作用，同時也是細胞間信號傳導的重要橋梁[12-13]。因此，在保證細胞增殖速度的同時，更要防治細胞過早衰老。雖然DMEM細胞營養成分濃度較高，但其營養成分種類較少，而F12培養基似乎可以彌補DMEM在此方面的缺陷，從而在促進細胞增殖過程中，避免了細胞過度老化[15]。而從β-半乳糖苷酶結果也驗證了以上猜測，對以上四組細胞進行相同次數傳代至38代可知，DMEM培養下的細胞衰老速度明顯快于其余三組細胞，而其余三組未見明顯差異。

另外，細胞自體回輸，除了要保證細胞數量，其質量及安全性也至關重要。其中膠原蛋白分泌量是檢驗成纖維細胞活性的最佳標準之一[15]。而對四組細胞培養液中膠原蛋白進行ELISA結果顯示，FM無血清培養基可使細胞穩定表達膠原蛋白，而DMEM+F12則有利于提高細胞前期膠原蛋白表達。另外，我們對培養30代的D組成纖維細胞進行軟瓊脂克隆形成實驗，其結果證實，在體外培養30代情況下，細胞暫時可保持正常生長狀態，無明顯腫瘤化生長跡象。

綜上所述，采取酶消化法有助于快速從人皮膚組織中獲得成纖維細胞，而采用DMEM+F12培養基有助于成纖維細胞的增殖及膠原蛋白的分泌。

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The Effects of Different Culture Medium on the Proliferation, Aging and Collagen Secretion of Fibroblasts From Skin

LA Wen-jun1,LIN Xiao-fa1,JIANG Wei1,WANG Yan1,YIN Wei-min2,LIN Jia-huan1,LIN Feng1
(1.School of Applied Chemistry and Biotechnology,Shenzhen Polytechnic,Shenzhen 518055, Guangdong,China; 2.Institute for Jun Zhuo Medical Cosmetology and Plastic Surgery of Shenzhen,Shenzhen 518040,Guangdong,China)

Objective To investigate the effects of different culture medium on the proliferation, aging and collagen secretion of fibroblasts.MethodsFibroblasts were obtained from healthy human ear skin after using two-step enzyme digestion method. According to different kinds of culture medium, they were divided into A group (serum-free medium), B group (DMEM+10%FBS), C group (RPMI-1640+10%FBS), and D group (DMEM+F12 (1∶1) +10%FBS), MTT assay,cell scratch assay,enzyme-linked immunosorbent assay,beta galactosidase assay,and soft agar colony formation test were used to compare the effects of different medium on cell proliferation,migration, collagen secretion,aging and mutation.ResultsA large number of fibroblasts were obtained from the tissue by enzyme digestion within 2d-4d; group B and group D proliferated more rapidly than group A and group C, which was the same as MTT cells proliferation;the result of scratch test showed that group B and group D migrated to the defect site more obviously than group A and group C; in addition, the collagen secretion of group D was the highest in all the four groups (P＜0.05),and after 30 passages,cells had no obvious signs of aging and neoplasia.ConclusionUsing two-step enzyme digestion method can obtain fibroblasts from human tissue quickly and efficiently, and the use of DMEM+F12 (1∶1) complete culture medium is beneficial to promote cell proliferation and collagen secretion and to delay cell aging.

fibroblasts; culture medium; collagen; cell proliferation; primary culture

Q813.1

A

1008-6455（2017）02-0068-05

2016-10-18

2016-12-25

編輯/張惠娟

深圳市科技創新委（GGJS20130331152344401）

林峰，男，教授，研究方向為精細化工；E-mail：linf2000@szpt.edu.cn