嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌遺傳性對其益生特性及貨架期菌數的影響

徐顯睿，李翠鳳，張宗博，謝璐璐，劉國強，李敏，趙林水，張蘭威

（1.杭州娃哈哈科技有限公司，杭州310018；2.青島根源生物技術集團食品實驗室，山東 青島266000；3.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東青島266000）

0 引言

益生菌除調節腸道健康[1-3]和提高免疫力[4-6]外，還可緩解兒童輪狀病毒、抗生素相關腹瀉[7-8]、便秘[9]，改善骨質疏松[10]、焦慮抑郁[11]、過敏性鼻炎[12]，降低血糖[13]，控制體重[14]，抑制炎癥等[15]，并且有研究表明對益生菌功效研究主要集中在嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌[16]，益生菌在產業化和生產流通中，需能保證有效菌數，較好穩定性，并保持活性和益生特性[17]，但在生產中存在菌株衰退導致生物學性狀發生改變[18]，且產業化后菌株功效驗證往往復雜和嚴格，因此將菌株能否保持篩選時益生特性及遺傳穩定性作為可實現產業化的首要條件和標準[19]。這是因為連續傳代和轉管次數可導致基因重排或缺失，影響其益生特性[20-23]。

本研究中菌株是經文獻報道，具有優良益生特性[24]。通過評價益生性狀遺傳性及貨架期存活率，篩選益生特性最佳菌株，旨在為益生菌產品產業化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，Z-38，Z-39，長雙歧桿菌Z-5，短雙歧桿菌Z-47，由青島根源生物技術集團公司食品菌株資源庫提供；鼠李糖乳桿菌LGG購于新西蘭恒天然公司。

MRS肉湯培養基（青島海博生物技術公司）；濃鹽酸、NaCl、NaOH、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、氯仿、L-半胱氨酸鹽酸鹽（均為分析純），上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

立式高壓蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-50SⅡ型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；超凈工作臺SW-CJ-1F型，蘇州安泰空氣技術有限公司；厭氧培養罐AG050型，廣州雷得生物技術有限公司；電子天平SE6001FZH，美國奧豪斯公司；1-7離心機，德國Sigma公司；p H計PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；紫外可見分光光度計756PC型，上海光譜儀器有限公司；生化培養箱LRH-250型，上海一恒科學儀器有限公司；旋渦振蕩器MX-S型，美國賽洛捷克公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株連續傳代

將供試菌株原始保藏菌種劃線于固體MRS培養基上，復壯2代，37℃恒溫培養48 h，根據菌落形態選取3個單菌落分別接種于MRS液體培養基中（雙歧桿菌添加L-半胱氨酸鹽酸鹽），37℃恒溫培養16 h，作為連續傳代的初始菌株。為保證菌株遺傳穩定，選擇穩定期進行菌株連續傳代，上述菌株培養12 h均處于穩定期，因此以12 h為1個傳代周期，連續傳代6次，獲得傳代菌液，備用。

1.3.2 菌體制備

按1.3.1中方法獲得不同菌株傳代4，5，6次菌液；4℃，8 000g條離心10 min，收集菌體。用p H值為6.8無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次，再用4～8 mL無菌PBS將菌體重懸，備用。

1.3.3 菌株耐模擬胃酸和腸液能力測定

按1.3.1中方法獲得傳代4，5，6次菌液；在4℃，4 000g條件下離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌2次，等體積重懸于人工胃液或腸液，在模擬胃液中孵育15，30，60 min（在人工腸液中孵育5 h），取重懸液稀釋后傾注于MRS瓊脂培養基平板，37℃培養48 h進行活菌計數，以鼠李糖乳桿菌LGG作為對照，分別計算連續傳代4、5、6代各菌株存活率，存活率為

式中：B0為菌懸液初始菌數；B1為人工胃液或腸液處理后菌懸液菌數。

1.3.4 菌株靜電作用率測定

以氯仿為路易斯酸，用p H值為6.8的PBS將

1.3.2 中菌懸液OD600調至0.6，加入1 mL氯仿，靜置5 min后充分震蕩120 s，再靜置10 min取水相，以鼠李糖乳桿菌LGG為對照，用石英比色杯測定OD600nm，疏水率為：

式中：OD0為菌懸液初始OD600nm；OD1為靜置10 min后水相OD600nm。

1.3.5 菌株自凝集率測定

用p H值為6.8的PBS將1.3.2中菌懸液OD600調至0.6，于37℃靜止放置2 h。以鼠李糖乳桿菌LGG作為對照，測定上層液體OD600nm，自凝集率為

式中：OD0為菌懸液初始OD600nm；OD1為靜置后菌懸液上層液體OD600nm。

1.3.6 菌粉貨架期活菌數測定

按1.3.1中方法將不同菌株傳代4，5，6次菌液制成菌粉，取1 g稀釋菌粉裝于雙層鋁箔袋中，密封，放置于25和-20℃條件下保存，分別于0，15，30，45，60，75，90 d取樣測定活菌數。

1.3.7 活菌數測定參照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》測定。

1.4 數據處理

采用OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同代數耐模擬胃液測定結果

由圖1可知，不同菌株傳代4次對模擬胃液耐受性不同，嗜酸乳桿菌Z-43、長雙歧桿菌Z-5、短雙歧桿菌Z-47對模擬胃液耐受性最差，孵育15 min無活菌存活。乳雙歧桿菌Z-1對模擬胃液耐受性最好，在模擬胃液中孵育60 min的存活率高達93.07%，其次為乳雙歧桿菌Z-36和Z-38，在模擬胃液中孵育60 min的存活率分別為65.66%和22.64%。乳雙歧桿菌Z-39在模擬胃液中孵育30 min存活率為58.79%，對模擬胃液耐受性一般，但較對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG均表現出更好的胃酸耐受能力。

圖1菌株傳代4次對模擬胃液耐受性

由圖2和圖3看出，相對于4次傳代，菌株經5，6次傳代對模擬胃液耐受性均呈下降趨勢，且孵育時間越長，對模擬胃液耐受性越差。乳雙歧桿菌Z-1傳代5次在模擬胃液中孵育15，30，60 min較4次傳代；耐受性分別降低31.56%，26.74%，56.27%；但與傳代6次在模擬胃液中孵育15，30，60 min存活率基本一致，分別為70.36%，68.26%，36.8%和68.16%，67.77%，41.76%。乳雙歧桿菌Z-36和Z-38連續傳代對模擬胃液耐受性變化趨勢與乳雙歧桿菌Z-1類似，傳代5和6次對模擬胃液耐受性變化不顯著，較4次傳代耐不同時間模擬胃液能力分別降低約16.14%，44.77%，37.42%和23.9%，7.59%，18.14%。乳雙歧桿菌Z-39連續傳代對模擬胃液中孵育15 min的存活率無影響，孵育30 min存活率由58.79%降低至2.68%。對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG經連續傳代對模擬胃液耐受性由19.83%降低至11.2%，變化趨勢不顯著，可能與鼠李糖乳桿菌LGG具有相對穩定的遺傳特性有關，也可能因為菌株本身耐模擬胃液的能力較差。因此綜上所述，4次傳代的乳雙歧桿菌Z-1表現為最佳耐胃酸菌株。

圖2菌株傳代5次對模擬胃液耐受性

圖3菌株傳代6次對模擬胃液耐受性

2.2 不同代數耐模擬腸液測定結果

由圖4可知，菌株傳代不同次數對模擬腸液的耐受性不同。嗜酸乳桿菌Z-43、乳雙歧桿菌Z-38和Z-39傳代4，5，6次對模擬腸液耐受能力基本一致，甚至有上升趨勢。其中乳雙歧桿菌Z-39傳代6次對模擬腸液耐受性為96.94%，提高約20%。嗜酸乳桿菌Z-43傳代5，6次耐模擬腸液能力較傳代4次提高8.83%和5.24%，分別為40.56%和36.97%。對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG經連續傳代提高約1.99%，上述菌株在該特性方面表現出較好的遺傳穩定性。乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，長雙歧桿菌Z-5，短雙歧桿菌Z-47連續傳代對模擬腸液耐受性呈逐漸降低的趨勢，降低18.34%~36.57%。因此綜上所述，傳代4，5，6次對嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-38和Z-39耐模擬腸液能力無影響，而其他菌株傳代4次則表現為菌株自身最佳耐腸液能力。

圖4菌株傳代不同次數對模擬腸液耐受性

2.3 不同代數靜電作用率測定結果

乳酸菌在腸道中以特異性和非特異性兩種方式黏附于小腸黏膜，非特異性作用方式主要與靜電作用率有關[25]。由圖5可知，菌株傳代不同次數對菌株表面攜帶產生靜電作用的電荷量不同。嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，Z-38，對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG傳代4，5，6次對氯仿的靜電作用率差異不顯著，差異在0.77%~9.74%；乳雙歧桿菌Z-39，長雙歧桿菌Z-5，短雙歧桿菌Z-47隨傳代次數增加，靜電作用率逐漸減弱，其中乳雙歧桿菌Z-39經6次傳代，其對氯仿靜電作用率降低最大，約34.12%。因此綜上所述，嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，Z-38連續傳代6次靜電作用率基本相同，其他菌株傳代4代靜電作用率最大。

圖5菌株傳代不同次數靜電作用率測定結果

2.4 不同代數自凝集率測定結果

乳酸菌的高自聚率有利于其在小腸黏膜上定植[26]。由圖6可知，菌株傳代不同次數自凝集率不同。嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36，短雙歧桿菌Z-47連續傳代6次自凝集率基本一致；其中菌株Z-1，Z-36，Z-47自凝集率有0.64%~4.23%提高，它們與對照菌株鼠李糖乳桿菌LGG在自凝集率方面均表現出較好的穩定遺傳能力，其他菌株傳代6次自凝集率較4代傳代則降低4.71%~10.55%。

圖6菌株傳代不同次數自凝集率測定結果

2.5 不同代數、溫度貨架期菌數測定結果

由圖7可知，菌株傳代不同次數制備菌粉在25℃（90 d）貨架期菌數存活率不同，嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36在貨架期菌數存活率及遺傳穩定性方面表現最好。嗜酸乳桿菌Z-43傳代4次在15，30，45，60，75，90 d菌 數 存 活 率 分 別 為80.34%，71.88%，66.86%，66.29%，69.38%，57.43%；與傳代5，6次菌數存活率變化曲線一致。傳代5次在90 d菌數存活率為55.92%，較4次傳代有較好遺傳穩定性，連續傳代6次在90 d菌數存活率為41.84%，降低約14.84%，差異不顯著。乳雙歧桿菌Z-1和Z-36傳代4，5，6次貨架期菌數變化趨勢基本相同，且遺傳穩定性均較好；在15，30，45，60，75，90 d菌 數 存 活 率 分 別 為91.54%~107.88%，79.45%~84.27%，50.77%~66%，39.33%~56.79%，30.31%~40.86%，25.82%~30.10%和88.81%~95%，73.23%~76.74%，47.75%~54.67%，35.6%~36.86%，27.30%~28.72%，22.5%~24.11%。

圖7 25℃菌粉貨架期活菌數測定結果

長雙歧桿菌Z-5貨架期菌數存活率遺傳穩定性較好，但貨架期菌數穩定性較上述菌株偏低，15 d存活率僅為37.27%，但90 d存活率約為23.16%，說明該菌株在前期衰減速度較快，而在后期相對穩定，這種變化趨勢與短雙歧桿菌Z-47相類似。其他菌株隨著連續傳代貨架期菌數存活率呈明顯下降趨勢，如乳雙歧桿菌Z-38傳代6次在45 d存活率較4次傳代下降約19%（60 d）下降約12.95%。其中乳雙歧桿菌Z-39貨架期菌數及遺傳穩定性最差，傳代6次在90 d存活率顯著減低，僅為0.37%。

圖8-20℃菌粉貨架期活菌數測定結果

由圖7和圖8可以看出，菌株傳代不同次數制備菌粉在-20℃（90 d）貨架期菌數存活率較25℃條件下顯著提高，并且穩定性更好，此外菌株連續傳代表現的遺傳穩定性也更好。嗜酸乳桿菌Z-43，乳雙歧桿菌Z-1，Z-36經連續傳代在90 d菌數存活率均在90%以上；其他菌株經連續傳代各代間菌數存活率基本一致，在-20℃（90 d）存活率在40%左右。其中短雙歧桿菌Z-47傳代6次在90 d菌數存活率為23.4%，較傳代4，5次降低約10%。因此綜上所述，以菌數穩定性指標考慮，嗜酸乳桿菌Z-43，短雙歧桿菌Z-47傳代5次，長雙歧桿菌Z-5，乳雙歧桿菌Z-1和Z-36傳代4，5，6次其貨架期穩定性最好；而乳雙歧桿菌Z-38，Z-39傳代4次為最佳。另外在產業化中將菌粉用載體稀釋并采用充氮包裝形式可改善菌粉貨架期穩定性[21,27]。

3 結論

對嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌進行連續傳代，分別測試傳代4、5、6次菌株對模擬胃液和腸液的耐受性，并以靜電作用率和自凝集率指標評價不同代數菌株黏附性，再分別考察菌株傳代不同代數制成菌粉在25、-20℃條件下保藏90 d的菌粉穩定性。結果表明嗜酸乳桿菌Z-43連續6次傳代其靜電作用率約為100%，在25和-20℃條件下90 d菌數存活率穩定在60%和90%以上，具有極好遺傳穩定性，黏附性和貨架期穩定性。其中乳雙歧桿菌Z-1傳代4次在模擬胃液、模擬腸液中分別孵育60 min和5 h的存活率為93.07%和106.5%，對氯仿靜電作用率為97.35%，表明其腸道定植能力較好。在25和-20℃條件下90 d菌數存活率分別為30.10%和92%，穩定性較好，表現為最佳抗性菌株。因此在后續菌粉產業化中，需對嗜酸乳桿菌Z-43凍干保護劑和產品劑型重點研究，提高菌劑對胃酸的耐受性。對于乳雙歧桿菌Z-1則需重點關注菌種保藏、活化次數，防止其益生性狀衰退。