馬鈴薯干腐病拮抗菌Pseudomonas sp.YL11發酵液理化性質測定及發酵條件優化

張紊瑋，王艷玲，贠建民

1.甘肅農業大學 食品科學與工程學院 甘肅 蘭州 730070；2.蘭州理工大學 生命科學與工程學院 甘肅 蘭州 730050

馬鈴薯干腐病是一種由鐮刀菌引起的田間和儲藏期都普遍發生的病害，主要引起塊莖腐爛，致使馬鈴薯品質降低，嚴重影響了其食用價值和經濟價值 [1]。我國是馬鈴薯生產大國，隨著“馬鈴薯主糧化戰略”的提出，馬鈴薯種植面積在逐年擴大，干腐病的發生也越來越嚴重，常年發病率高達30%，由此造成馬鈴薯產量損失40%-50%[2]。甘肅是我國馬鈴薯主產區之一，硫色鐮刀菌、腐皮鐮刀菌和接骨木鐮刀菌是造成馬鈴薯干腐病的優勢病原菌[3,4]。目前，對馬鈴薯干腐病以化學防治為主，化學農藥雖然短期有效，但長期反復施用，會造成藥劑殘留、產生耐藥性菌株以及環境污染等問題而逐漸受到限制[5,6]。因此，使用高效、合理、環保的方法控制病害的發生顯得尤為重要，生物防治便成了國內外研究的熱點[7-9]。

生物防治在農業生態系統中是一種很有前景的防治方法，這種從自然界中分離、篩選有益微生物并用于病原菌的拮抗、病害控制的防治方法，具有高效、無毒、無殘留等特點[10]。拮抗菌株用于生物防治時，首先要考慮該菌株易于實現工業化生產，同時要求菌劑具有穩定性好、活性高、環保等特點[11-13]。為此，本試驗以前期分離獲得的一株對馬鈴薯干腐病病原菌——硫色鐮刀菌有拮抗作用的Pseudomonas sp.YL11為研究對象，進行發酵液抑菌成分理化性質的探索，并以LB培養基作為YL11菌株發酵條件優化的基礎培養基，通過添加輔助碳源、氮源及無機鹽，對溫度、pH值、轉速、接種量、裝液量及培養時間進行優化，旨在為該菌株的田間應用和活性產物的開發提供必要的前期基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株Pseudomonas sp.YL11為甘肅定西地區馬鈴薯根際土壤中分離獲得；供試病原真菌硫色鐮刀菌（Fusarium sulphureum）由甘肅農業大學采后生物學與技術實驗室保藏。

1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，pH自然，121℃高壓滅菌20min。

LB培養基：蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL，pH7.0，121℃高壓滅菌20min。

LB液體培養基：LB固體培養基中不加瓊脂。

1.3 方法

1.3.1 預處理

1.3.1.1 指示菌的活化

將在PDA培養基，28℃培養7d的F. sulphureum用無菌水沖洗孢子，制備孢子懸浮液，用血球計數板計數，調整孢子濃度為1.5×105CFU/mL，分裝至1mL，無菌離心管中于4℃保存，一周內使用[14]。

1.3.1.2 供示菌的活化

將-20℃保藏Pseudomonas sp.YL11菌株在LB固體培養基上劃線，30℃培養48h，挑單菌落接種到LB液體培養基中，30℃培養24h，反復傳代接種培養3～4次。

1.3.1.3 無菌發酵液的制備

Pseudomonas sp.YL11發酵液10000r/min離心15min后，收集上清液即為發酵上清液。將上清液用0.22μm無菌濾膜過濾，收集濾液即為無菌發酵液。

1.3.2 菌株Pseudomonas sp. YL11代謝產物理化性質測定

1.3.2.1 熱穩定性測定

將發酵液分別置于30℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃，100℃下處理30min，未經處理的發酵液作對照，以F.sulphureum為指示菌，牛津杯法測抑菌活性。

1.3.2.2 pH穩定性測定

將發酵液用0.5M HCl和0.5M NaOH處理依次調節pH至3，4，5，6，7，8，9，10，靜置2h后將pH調回自然pH（原始發酵液pH值為7），未經處理的發酵液作對照，以F. sulphureum為指示菌，牛津杯法測抑菌活性。

1.3.2.3 紫外光照穩定性測定

將發酵液分裝于1.5mL離心管中置于20W紫外燈下距離20cm處敞口照射1h，2h，4h，6h，8h，10h，12h后，未經處理的發酵液作對照，以F. sulphureum為指示菌，牛津杯法測抑菌活性。

1.3.3 培養基組分的優化

在LB培養基中，以酵母提取物為基本碳源物質，分別添加1%的其他碳源物質（葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖）；以蛋白胨為基本氮源物質，分別添加1%其他氮源物質（尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、磷酸氫二銨）；以氯化鈉為基本無機鹽，分別添加0.5%其他無機鹽（氯化鉀、硫酸鎂、氯化鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉），以不額外添加碳源、氮源、無機鹽的LB液體培養基作對照，30℃，120r/min振蕩培養4d后，測定發酵上清液對F. sulphureum的抑菌活性，每個處理重復3次。

1.3.4 發酵條件的優化

在上述最佳培養基基礎上，在裝液量為30mL/100mL、轉速120r/min和30℃條件下分別改變培養基的發酵時間（12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、100h、120h）、發酵溫度（25℃、28℃、30℃、37℃、40℃）和初始pH值（pH5、pH5.5、pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8），以發酵液對F. sulphureum的抑菌活性為指標，確定最佳發酵時間、發酵溫度和pH值。在篩選出最佳pH值、發酵溫度和發酵時間的條件下改變接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、裝液量（10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50mL/100mL）、轉速（100、120、150、180r/min），以發酵液對F. sulphureum的抑菌活性為指標，確定最佳接種量、裝液量和轉速。同時用分光光度法測定波長600nm處的吸光度值，每個處理重復3次。

2 結果與分析

2.1 發酵液理化性質

2.1.1 熱穩定性

YL11發酵液代謝產物具有較好的熱穩定性，經過30℃-50℃各處理30min后活性基本保持穩定，60℃-80℃各處理30min活性略有降低，抑菌活性為對照的90.1%-87.3%。90℃-100℃各處理30min活性下降的比較明顯，抑菌活性為對照的63.9%-59.1%。

2.1.2 pH穩定性

在pH值低于4時，發酵液抑菌活性完全喪失，表明發酵液代謝產物對酸敏感；pH4-5范圍和pH9-10范圍內活性均有降低，抑菌活性為對照的45.1%-88.7%。pH6-8的范圍內活性保持穩定，說明YL11適合于中性或弱堿性環境，分離純化的最佳pH為6-8之間。

2.1.3 紫外光照穩定性

在紫外光下連續照射12h后，YL11發酵液活性基本保持不變，抑菌活性仍然能達到對照的83.7%，表明YL11發酵液具有良好的紫外光照穩定性。

2.2 發酵培養基組分的優化

由圖1可見，葡萄糖作為輔助碳源時發酵液的抑菌活性最高，抑菌圈直徑達到26.7mm，利用麥芽糖和蔗糖的發酵液抑菌活性相當不存在顯著性差異p＞0.05，抑菌圈分別為25.2mm和24.9mm，其次是淀粉。表明YL11利用單糖的能力要強于二糖和多糖，所以選擇葡萄糖為最佳碳源。

由圖2可見，當磷酸二氫銨作為輔助氮源時，發酵液抑菌活性最大，抑菌圈直徑為28.0mm，表明對磷酸二氫銨的利用效率最高。尿素最低，抑菌圈直徑為22.9mm，甚至低于LB基本培養基對照（25.4mm），可能尿素不利于YL11對氮源的利用或者產生了其他化學物質抑制了其抑菌活性產物的活性。

由圖3可見，當硫酸鎂作為輔助無機鹽時，抑菌活性最高，抑菌圈直徑達到29.7mm，所以選擇硫酸鎂為發酵液的無機鹽。因此，以LB培養基為基礎培養基，確定YL11的最佳配方組成為：葡萄糖1%，酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，磷酸二氫銨1%，氯化鈉1%，硫酸鎂0.5%。抑菌圈大小為29.7mm，采用傳統LB培養基，抑菌圈大小為25.4mm，由此可見，培養基優化后能明顯提高發酵液的抑菌活性。

圖2 不同氮源對YL11抑菌活性的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the antagonistic activity of YL11

圖3 不同無機鹽對YL11抑菌活性的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on the antagonistic activity of YL11

2.3 發酵條件的優化

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，抑菌活性逐步增大，發酵時間為100h時，抑菌活性最高，抑菌圈直徑為30.7mm，而后隨著時間延長抑菌活性逐漸下降。發酵時間短，抑菌活性物質產量低，抑菌性能低；發酵時間過長，抑菌活性也逐漸下降，可能原因是隨著培養時間的延長，YL11菌體的大量繁殖及營養基質的逐步消耗，菌體開始衰老、自溶，所以確定發酵時間為100h。

圖4 培養時間對YL11生長及抑菌活性的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the growth and antagonistic activity of YL11

由圖5可知，YL11菌株在25℃-40℃時均可產生抑菌活性物質。在28℃時，抑菌活性最大，抑菌圈直徑為30.7mm，37℃及40℃時，抑菌活性均有降低，這可能是溫度升高不利于YL11菌體生長所致。所以確定發酵溫度為28℃。

由圖6可知，發酵液初始pH在5和8時對活性物質的影響較小，當初始發酵液pH為7時抑菌活性最大，抑菌圈直徑為30.7mm，在弱酸及弱堿條件下抑菌活性均有輕微下降。所以確定發酵pH為7。

圖5 溫度對YL11生長及抑菌活性的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth and antagonistic activity of YL11

圖6 不同初始pH值對YL11生長及抑菌活性的影響Fig.6 Effect of initial pH on the growth and antagonistic activity of YL11

由圖7可知，YL11發酵液的接種量在1%-9%范圍內均能達到較高的抑菌效果，當接種量為3%時抑菌圈直徑最大，達到30.7mm，接種量大于3%時，菌株生物量及抑菌活性開始逐漸降低，確定接種量為3%。

由圖8可知，在100mL的錐形瓶中裝液量為30mL，發酵液抑菌活性最強，隨著裝液量的增加，發酵液抑菌活性逐漸降低，說明搖瓶內空氣含量對YL11產活性代謝產物影響較大，但過低的裝液量會導致營養物質供應不足菌體生物量下降進而影響抑菌活性。所以確定裝液量為30ml。

圖7 接種量對YL11生長及抑菌活性的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on the growth and antagonistic activity of YL11

圖8 裝液量對YL11生長及抑菌活性的影響Fig.8 Effect of liquid volume on the growth and antagonistic activity of YL11

由圖9可知，YL11菌株的生物量隨轉速的增加先增加后減少，在轉速120r/min時生物量和抑菌活性均達到峰值，轉速進一步增大菌體生物量略有下降，抑菌活性略有升高，表明高轉速對菌體結構產生破壞從而導致活性物質釋放。120r/min-180r/min均不存在顯著性差異p＞0.05，綜合考慮，選擇120r/min為最佳搖床轉速。

圖9 搖床轉速對YL11生長及抑菌活性的影響Fig.9 Effect of rotational speed on the growth and antagonistic activity of YL11

3 結論與討論

本研究以前期分離獲得的一株對馬鈴薯干腐病病原菌——F. sulphureum有拮抗作用的Pseudomonas sp.YL11為研究對象，對發酵液理化性質進行測定，并以LB培養基作為YL11菌株發酵條件優化的基礎培養基，通過添加輔助碳源、氮源及無機鹽，對溫度、pH值、轉速、接種量、裝液量及培養時間進行優化。

結果表明：YL11抑菌活性成分具有較好的熱穩定性，經過30℃-50℃各處理30min后活性基本保持穩定，60℃-80℃各處理30min活性略有降低，抑菌活性為對照的90.1%-87.3%；pH6-8的范圍內活性保持穩定，適合于中性或弱堿性環境；紫外燈照12h后抑菌活性基本不變，仍然能達到對照的83.7%，具有良好的紫外光照穩定性。

最佳培養基配方為：葡萄糖1%，酵母提取物0.5%，蛋白胨1%，NH4H2PO4 1%，NaCl 1%，MgSO4 0.5%，發酵溫度28℃，初始pH7，接種量3%，裝液量30 mL /100mL，搖床轉速120r/min，發酵時間100h，在此條件下發酵上清液對F. sulphureum的抑菌活性最強，抑菌圈直徑達到30.7mm，與優化前25.4mm相比，顯著提高了抑菌效果，為今后工業化生產提供理論依據和參考。本研究僅探討了拮抗菌株發酵培養的條件及其影響因素，我們今后將對抑菌機制及活性物質的分離提取進行系統的研究，為馬鈴薯干腐病的生物防治打下基礎。

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