麥芽炒香過程中有效成分與無效成分動態變化規律研究

楊華生++譚麗霞++吳維剛++黎曉麗++聞麗珍++吳璐

[摘要]僅從麥芽中淀粉酶、麥黃酮等“有效成分”的角度并不能科學闡釋炒麥芽“消食化滯”作用較生麥芽更強的作用機制，該實驗采用HPLC測定麥芽炒制過程中麥黃酮、槲皮素、山柰酚、兒茶素、阿魏酸等傳統“有效成分”及5羥甲基糠醛、丙烯酰胺等“無效成分”的含量，運用HCA，PCA，PLSDA分析炒制過程中“有效成分”與“無效成分”的動態變化規律。結果HCA，PCA方法能將在不同溫度下炒制的麥芽分為4類，PLSDA分析表明炒制溫度主要影響5羥甲基糠醛、丙烯酰胺等“無效成分”的含量，而對麥黃酮等“有效成分”的含量影響較小。同時，隨炒制時間的延長，5羥甲基糠醛含量在2 min開始顯著增加，16 min達到穩態，而丙烯酰胺在18 min時開始產生并持續增加；根據各成分的含量，HCA可將不同時間的炮制品及生品聚為5類。研究結果表明麥芽炒香過程中，“無效成分”的含量變化與炮制“火候”密切相關，而“無效成分”的動態變化規律可能為麥芽炒制工藝的評價以及功效機制闡釋提供科學依據。

[關鍵詞]麥芽； 動態變化規律； 無效成分； 主成分分析； 聚類分析

Dynamic change rules of active ingredients and inactive ingredients

from Fructus Hordei Germinatus with frying process

YANG Huasheng， TAN Lixia， WU Weigang， LI Xiaoli， WEN Lizhen， WU Lu*

（Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China）

[Abstract]It is not scientific to explain that fried Fructus Hordei Germinatus is more effective than row Fructus Hordei Germinatus in resolving food stagnation from the aspects of amylase， tricine and other "active ingredients" In the present experiment， the contents of active ingredients including quercetin， tricine， kaempferol， catechin， ferulic acid and inactive ingredients including 5hydroxymethyl furfural， acrylamide in frying process were determined by HPLC The dynamic change rules of active ingredient and inactive ingredients in the frying process were investigated by HCA， PCA and PLSDA analysis The results showed that the Fructus Hordei Germinatus samples with different frying temperatures were classified into 4 groups by HCA and PCA analysis PLSDA analysis showed that frying temperature mainly impacted the contents of inactive ingredients including 5hydroxymethyl furfural and acrylamide， with less effects on the contents of active ingredients Simultaneously， with the increase of time in frying process， the content of 5hydroxymethyl furfural was significantly increased from 2 min and became stable at 16 min， while the content of acrylamide was increased continuously from 18 min Based on the variation of the contents of various ingredients， samples at different frying time were classified into 5 groups The results showed that the content changes of "inactive ingredients" were closely related to the duration and degree of frying process， and the dynamic change rules of "inactive ingredients" can provide scientific basis for evaluating the frying process and elucidating the efficacy mechanism of Fructus Hordei Germinatus

[Key words]Fructus Hordei Germinatus； dynamic change rules； inactive ingredients； PCA； HCA

doi：10.4268/cjcmm20162315

麥芽為禾本科一年生草本植物大麥Hordeum vulgare L的成熟果實經發芽干燥而得，主要含有淀粉酶、蛋白酶等酶類成分，是中醫臨床常用的一味消食藥；麥芽中還含有具抗菌、抗病毒、抗腫瘤等活性的麥黃酮、槲皮素、山柰酚、兒茶素、阿魏酸等成分[15]。麥芽一直沿用“炒黃炒香”入藥的傳統，北齊醫學家徐之才有“麥芽能消食全在于炒”的論述，《藥品辨義》中麥芽有“炒香開胃，以除煩悶”的記載。麥芽炒制時也多以上述“有效成分”作為評價指標。傳統中醫藥理論及臨床應用均表明，與生麥芽比較，炒麥芽的“消食化滯”作用更強。而現代研究表明，與生麥芽比較，炒麥芽中淀粉酶、蛋白酶的活性必然降低；同時，麥芽中的麥黃酮等有效成分的含量升高與“消食化滯”作用增強是否存在必然聯系，仍缺乏相關報道?？梢?，僅從淀粉酶、蛋白酶、麥黃酮、槲皮素、山柰酚、兒茶素、阿魏酸等“有效成分”的角度并不能科學評價麥芽的炒制工藝。

近年來，中藥炮制中時產生的Maillard反應產物（maillard reaction products，MRPs），如5羥甲基糠醛、丙烯酰胺等“無效成分”的活性引起廣泛關注，本實驗利用HPLC測定不同炒制程度麥芽樣品中麥黃酮、槲皮素、山柰酚、兒茶素、阿魏酸5種“有效成分”及5羥甲基糠醛、丙烯酰胺2種“無效成分”的含量，利用聚類分析法（hierarchical cluster analysis， HCA）、主成分分析法（principal component analysis， PCA）對不同炒制程度的麥芽進行聚類分析，利用偏最小二乘判別分析法（partial least squaresdiscriiminate analysis， PLSDA）分析7種成分在麥芽炒香過程中含量的變化，以期為麥芽炒制工藝的評價以及功效機制闡述提供科學依據。

1材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀（G1311C四元泵，G4212B DAD檢測器）；高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；水分測定儀（上海越平科學儀器有限公司）；非接觸式紅外測溫儀（東莞萬創電子制品有限公司）；電磁爐（杭州九陽生活電器有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

槲皮素（中國食品藥品檢定研究院，批號100081201509）、5羥甲基糠醛（中國食品藥品檢定研究院，批號111626200301）、丙烯酰胺（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號A108467）、阿魏酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號1506030）、山柰酚（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：A1619011）、麥黃酮（上海源葉生物科技有限公司，批號T05A7Z12520）、兒茶素（上海同田生物技術股份有限公司，批號15082731）。試劑甲醇、乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其他為分析純。

生麥芽（產地安徽，批號150501，160417）購自亳州市佰世信中藥飲片有限公司，經江西中醫藥大學付小梅副教授鑒定為禾本科植物大麥H vulgare的成熟果實，經發芽干燥而得。

2方法

215羥甲基糠醛、兒茶素、阿魏酸含量測定方法的建立

211色譜條件Kromasil C18 （46 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相為甲醇（A）1%冰乙酸（B），梯度洗脫（0～20 min，2% A，20～60 min，2%～445% A）；采用波長切換法，檢測波長為283 nm（0～13 min），320 nm（13～17 min），283 nm（17～50 min），320 nm（50～60 min）；進樣量20 μL；流速08 mL· min-1；柱溫30 ℃。

212對照品溶液的制備精密稱定5羥甲基糠醛、兒茶素、阿魏酸對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為018，066，0376 g·L-1的對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液適量，加甲醇制成5羥甲基糠醛、兒茶素、阿魏酸質量濃度分別為36，132，376 mg·L-1的混合對照品溶液。

213供試品溶液的制備取麥芽粗粉50 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水50 mL，稱定質量，超聲提取40 min，放冷，再稱重，用蒸餾水補足失重，搖勻，取2 mL溶液至離心管， 9 000 r·min-1離心2 min，取上清液，過濾，即得。

22槲皮素、麥黃酮、山柰酚測定方法的建立

221色譜條件Kromasil C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）1%冰乙酸（B），梯度洗脫（0～60 min，20%～35% A，60～70 min，35%～100% A），檢測波長345 nm，流速08 mL·min -1，進樣量20 μL，柱溫30 ℃。

222對照品溶液的制備精密稱定槲皮素、麥黃酮、山柰酚對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為096，0148，0736 g·L-1的對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液適量，加甲醇制成槲皮素、麥黃酮、山柰酚質量濃度分別為96，148，5888 mg·L-1的混合對照品溶液。

223供試品溶液的制備取麥芽粗粉50 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，回流提取3 h后，過濾，揮干，用3 mL甲醇溶解，過濾，即得。

23丙烯酰胺含量測定方法的建立

231色譜條件Kromasil C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇水（2∶98），檢測波長210 nm，流速05 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。

232對照品溶液的制備精密稱定丙烯酰胺對照品適量，加甲醇制成質量濃度1448 g·L-1的對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液適量，加甲醇制成質量濃度分別為1448，1448 mg·L-1對照品溶液。

233供試品的制備取麥芽粗粉20 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水20 mL，稱定質量，冰浴超聲提取25 min，放冷，再稱重，用蒸餾水補足失重，搖勻，取2 mL溶液離心，9 000 r·min -1，2 min，過濾，即得。

24炒制溫度對麥芽中7種成分含量的影響

取同一批生麥芽，除去雜質，均分成10份，每份50 g，分別在90，120，140，160，180，200，220，240，260 ℃炒制，在炒制過程中用紅外測溫儀監測鍋內溫度，炒制時間均為20 min，得不同炒制溫度及生麥芽樣品，共10份，HPLC測定麥芽中7種成分含量，用水分測定儀測定樣品含水量，計算相關成分的含量[6]。

25炒制動力學研究

取生麥芽，除去雜質，均分成13份，每份50 g，將其置于鍋內，保持溫度在220 ℃，在炒制過程中用紅外測溫儀監測鍋內溫度，待鍋溫達到220 ℃開始計時，炒制時間分別為2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，26 min，得不同炒制時間及生麥芽樣品，共13份，HPLC測定麥芽中7種成分含量，用水分測定儀測定樣品含水量，計算相關成分的含量。

3結果

315羥甲基糠醛、兒茶素、阿魏酸方法學考察

在211條件下，各成分分離度良好，見圖1。5羥甲基糠醛、兒茶素、阿魏酸的標準曲線分別為y=11196x-0093 2（R2=0999 9），y=0721 8x （R2=0999 9），y=4852 3x+0267 6（R2=0999 9），定量范圍分別為18～90，66～264，188～752 ng；精密度的RSD分別為14%，18%，20%，精密性良好；重復性試驗的RSD分別為25%，22%，30%，重復性良好；穩定性試驗的RSD分別為077%，21%，29%，表明供試品溶液在75 h內穩定；5羥甲基糠醛、兒茶素、阿魏酸平均回收率分別為9782%，9760%，9816%，RSD分別為28%，29%，27%（n=6）。

1 5羥甲基糠醛；2兒茶素；3阿魏酸；A對照品；B樣品。

32槲皮素、麥黃酮、山柰酚方法學考察

在221條件下，各成分分離度良好，見圖2。槲皮素、麥黃酮、山柰酚的標準曲線分別為y=0987x+0667 （R2=0999 8），y=3868 4x+0544 4 （R2=0999 8），y=1443 9x+0634 4 （R2=0999 9），定量范圍分別為48～1156，074～1776，294～7066 ng；精密度的RSD分別為050%，084%，073%，精密性良好；重復性的RSD分別為29%，27%，27%，表明重復性良好；穩定性試驗的RSD分別為23%，23%，19%，供試品溶液在24 h內穩定；槲皮素、麥黃酮、山柰酚的平均回收率分別為9734%，1029%，1016%，RSD分別為24%，22%，16%（n=6）。

33丙烯酰胺方法學考察

在231條件下，成分分離度良好，對照品與樣品色譜圖見圖3。標準曲線為y=12191x+5132 4（R2= 0999 9），定量范圍在0724～11584 ng；精密度的RSD為091%，精密性良好；重復性的RSD為15%，表明重復性良好；穩定性見圖4，表明麥芽樣品溶液中的丙烯酰胺在15 h內穩定；加樣回收率試驗的平均回收率為9966%，RSD為20%（n=6）。

34炒制溫度對成分含量的影響

341不同炒制溫度的麥芽含量測定麥芽（批號150501）中7種成分及含水量結果見表1。由表1可知，“無效成分”5羥甲基糠醛、丙烯酰胺在不同的炒制溫度下，含量變化較大，其RSD分別為166%，129%，表明炒制溫度顯著影響5羥甲基糠醛、丙烯酰胺等“無效成分”的含量，而傳統“有效成分”中，阿魏酸由于熱不穩定整體上表現為逐漸下降，而兒茶素、槲皮素、麥黃酮、山柰酚的含量變化相對較少，其RSD均少于20%。結果表明，炒制溫度主要影響“無效成分”以及熱不穩定性成分的含量，

而對熱相對穩定的“有效成分”的含量影響較少。

342HCA分析以麥芽生品及炮制品中7種成分的含量為指標，利用SPSS 190軟件，采用平方歐氏距離作為樣品的測度，對10個樣品進行聚類分析，結果見圖5。結果10份樣品可聚為4類。生麥芽和90 ℃炒制樣品聚為一類，說明生麥芽與較低溫度炒制時，7種成分的含量無明顯差別，進一步表明炒制時溫度不能太低。120，140，160，180，200 ℃5個溫度下炒制的樣品聚為一類，在此溫度范圍內，丙烯酰胺開始產生，但速度緩慢；220 ℃的樣品單獨聚為一類，相較于120～200 ℃的樣品，其5羥甲基糠醛顯著增加；240，260 ℃的樣品，其5羥甲基糠醛、丙烯酰胺含量均較高，聚為一類。

343PCA，PLSDA分析在聚類分析的基礎上，采用SIMCAP 115軟件，以樣品中7種成分含量為特征變量值進行PCA分析，以特征值大于1為提取標準，提取到2個主成分，以主成分矢量為坐標軸作圖，見圖6，所有炒制品均在95% 置信區間內，說明所有樣本的總體特征基本一致；以樣品的離散度分析，PCA亦分為4類，與HCA結果一致。

對這4類樣品進行PLSDA分析，見圖7?！盁o效成分”5羥甲基糠醛、丙烯酰胺在不同炒制溫度的區分中具有較大的貢獻率，而“有效成分”的貢獻率較低。5羥甲基糠醛、丙烯酰胺均為Maillard的中間產物，研究表明，5羥甲基糠醛是具有一定的抗氧化、抗自由基、抗菌等作用[7]，其作用與麥芽的“消食化滯”作用可能存在相關性，而丙烯酰胺則是公認的毒性成分。PCA 和PLSDA 分析結果表明，麥芽炒制最顯著的標記物為5羥甲基糠醛、丙烯酰胺，同時結合上述2種成分的作用，因此選擇220 ℃為麥芽炒制溫度。

35炒制動力學研究

351不同炒制時間的麥芽含量測定麥芽（批號160417）中7種成分及含水量結果見表2，圖8。

由表2可知，“無效成分”丙烯酰胺、5羥甲基糠醛在炒制過程中，含量變化較大，其RSD分別為212%，77%。圖8表明，在0～18 min，丙烯酸胺的含量為0或超出檢測限，20 min后開始增加；在0～16 min內，5羥甲基糠醛含量持續增加，16 min后，含量基本保持不變；丙烯酰胺、5羥甲基糠醛均為Maillard反應的中間產物，根據丙烯酰胺、5羥甲基糠醛在炒制過程含量的變化規律，推測麥芽在炒制初期、中期發生了Maillard反應，其產物以5羥甲基糠醛為主，而炒制后期，其產物主要以丙烯酰胺為主。在炒制過程中，“有效成分”中兒茶素表現為先升高后降低，阿魏酸的含量呈現先降低后達到平衡的趨勢，而槲皮素、麥黃酮、山柰酚含量變化不明顯。

352HCA分析以麥芽生品及不同時間炮制品中7種成分的含量為指標，利用SPSS 190軟件，運用平方歐氏距離作為樣品的測度，對13個不同炒制時間樣品進行聚類分析，結果見圖9，生麥芽為一類，其中含有微量的5羥甲基糠醛，表明麥芽在干燥過程中可能會產生少量的5羥甲基糠醛，而本實驗2批生麥芽中并無丙烯酰胺，表明丙烯酰胺多在溫度較高的炒香過程中產生；2～4 min為一類，為炒制初級階段，5羥甲基糠醛的含量隨時間緩慢增加；6～14 min為一類，為炒制中級階段，5羥甲基糠醛的含量隨時間延長快速增加；16～18 min為一類，為炒制末期階段，5羥甲基糠醛含量增加到最大值，但并沒有產生丙烯酰胺；20～26 min為一類，丙烯酰胺開始產生，為麥芽炒制“火候”太過階段。結合5羥甲基糠醛、丙烯酰胺的作用，麥芽炒制時間以16～18 min為宜。

4討論

中藥“炒香”過程中，由于熱的作用，藥材中的“有效成分”也會發生量和/或質的改變?！傲俊钡淖兓c“有效成分”溶出量變化相關，“炒香”改變了藥材的組織結構，降低了化學成分的擴散阻力，提高了溶出量，同時，熱不穩定成分由于“熱”的作用而發生降解而致溶出量減少；“質”的變化與新物質的生成或原物質的消減相關，因此，在中藥“炒香”工藝研究中，多以“有效成分”量和/或質為評價指標。另一方面，藥材中一些傳統意義上的“無效成分”如糖、氨基酸、蛋白質等在“炒香”過程發生化學反應而產生新的的成分，在這些復雜的反應中，Maillard反應是近年來研究較多的反應之一，其MRPs多為具有揮發性的醛、酮，多為具有“香”味的物質，且具有一定的活性，因此僅從“有效成分”的角度并不能科學、全面闡述麥芽炒香后“消食化滯”作用較生麥芽更強的作用機制。近年來研究者開始逐漸關注藥材中蛋白質、氨基酸、麥芽糖、葡萄糖以及炮制中產生的5羥甲基糠醛、丙烯酰胺等傳統意義上的“無效成分”在“炒香”過程中的變化[814]。對麥芽而言，傳統意義上的“無效成分”與“有效成分”并沒有明顯的界限，從“無效成分”的角度研究麥芽炒香的物質基礎以及作用機制功效機制更具有科學性。實質上，對大多數中藥來說，“香”的產生與“無效成分”之間更具相關性，因此，從“無效成分”的角度為研究中藥“炒香”工藝及功效闡釋提供了新的視角與方法。

本實驗根據各成分性質，建立了麥芽中7種成分HPLC含量測定方法，并進行了方法學考查。采用波長切換法測定5羥甲基糠醛、兒茶素、阿魏酸的含量，以各成分的最大吸收波長為檢測波長，提高靈敏度。

麥芽含有與“消食化滯”作用相關的淀粉酶、蛋白酶成分，酶的化學本質為蛋白質，其發揮作用的最佳溫度為37 ℃，在麥芽炒制時，酶的活性必然下降，因此，本實驗中沒有考察炒制對麥芽中酶活性的影響，因此，進一步的實驗將驗證炒制對麥芽中酶活性的影響，并研究參與Maillard反應的還原糖、氨基酸等其他“無效成分”在炒制過程中的含量變化，以期進一步闡明炒麥芽“消食化滯”的作用機制。

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[責任編輯孔晶晶]