不同干燥方法對川麥冬甾體皂苷和高異黃酮的影響

王菲 尚展鵬++馬志國++劉思燚 王子健 張加余

[摘要]該研究以川麥冬為研究對象，考察不同干燥方法對麥冬藥材中化學成分的影響。取新鮮川麥冬塊根粗粉，分別采用50 ℃烘干干燥、80 ℃烘干干燥、-70 ℃冷凍干燥3種方法進行干燥處理，應用HPLCDADELSDMSn多檢測器串聯技術，篩選鑒定干燥過程中變化顯著的高異黃酮類和甾體皂苷類化學成分。結果顯示：與新鮮麥冬藥材的HPLC圖相比，50 ℃烘干干燥最能保持藥材固有化學成分；80 ℃烘干干燥、-70 ℃冷凍干燥方法則對化學成分影響較大；結合HPLCHRMSn數據，最終篩選了36個差異性成分，并鑒定了其中24個差異性成分（11個甾體皂苷和13個高異黃酮）的結構。結果表明，不同干燥方法對川麥冬中甾體皂苷和高異黃酮有明顯影響；從成本、成分含量和實用性綜合分析，50 ℃烘干干燥更有利于川麥冬藥材中固有成分的保留，可以為川麥冬藥材的產地干燥加工提供借鑒。

[關鍵詞]川麥冬； 甾體皂苷； 高異黃酮； 干燥方法； HPLCUVELSDMSn

Influence of different drying methods on steroidal saponins and

homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus

WANG Fei1， SHANG Zhanpeng1， MA Zhiguo2， LIU Siyi1， WANG Zijian3， ZHANG Jiayu3*， LU Jianqiu4*

（1School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2College of Pharmacy， Jinan University， Guangzhou 510632， China；

3Beijing Institution of Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

4Library of Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

[Abstract]To study the influence of three different drying methods （including 50 ℃drying， 80 ℃drying and -70 ℃freezedrying methods） on steroidal saponins and homoisoflavonoids in Ophiopogon japonicus，a HPLCDADELSDMSn method was investigated to screen and identify the differential components Through comparing the HPLC chromatograms with that of fresh O japonicus， 50 ℃drying medicine was similar with fresh medicine whereas the other two drying methods had great influence on the components of O japonicus In this study， 36 differential components were screened， among which 24 constituents（13 homoisoflavonoids and 11 steroidal saponins） were identified via HPLCLTQOrbitrap MSAs a result， it was revealed that different drying methods had significant influences on the components of steroidal saponins and homoisoflavonoids Among them， 50 ℃drying method was the most suitable drying approach when the stability of components， cost and practicability were considered

[Key words]Ophiopogon japonicus； steroidal saponins； homoisoflavonoids； drying methods； HPLCDADELSDMSn

doi：10.4268/cjcmm20162317

麥冬Ophiopogon japonicas （Lf） KerGawl為百合科植物麥冬的干燥塊根，主產于四川、浙江等地，故有川麥冬和杭麥冬之分[1]。麥冬為常用滋陰中藥，具有養陰生津、潤肺清心之功效[2]?，F代藥理學研究表明，麥冬具有顯著的耐缺氧、改善心血管、抗癌、降血糖等活性[35]。

藥材產地干燥加工是中藥生產與品質形成的重要環節，其間可能會發生成分相互轉化[6]。2015年版《中國藥典》中雖規定了麥冬的產地加工干燥方法，但未見具體干燥方法、干燥溫度等詳細參數[7]。目前，有文獻報道不同干燥方法對麥冬品質的影響[810]，但僅局限于對特定主要活性成分的定量研究，并未系統研究差異性化學成分。因此，本研究應用HPLCDADELSDMSn多檢測器串聯技術，對不同干燥方法下川麥冬差異性甾體皂苷和高異黃酮類成分進行篩選鑒定，探討不同干燥方法對藥材中化學成分的影響，以期為川麥冬藥材產地干燥加工提供科學依據。

1材料

川麥冬鮮品于2016年春季采于四川雅安，經北京中醫藥大學譚鵬副教授鑒定為百合科植物川麥冬O japonicus的新鮮塊根。采收后，選擇個體完整、色澤鮮艷的新鮮麥冬，除去須根，以清水洗去表面雜質，用保鮮塑料膜密封，置于冰箱內4 ℃低溫保存。

高異黃酮類對照品（5，7，4′三羥基6甲基二氫高異黃酮、麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、5，7，2′三羥基4′甲氧基6，8二甲基二氫高異黃酮、麥冬二氫高異黃酮E）和甾體皂苷類對照品（ophiopojaponin C， 14hydroxysprengerinin C， ophiopogonin D′， ophiopogonin D， pennogenin 3O[αLrha（1→2）][βDxyl（1→4）]βDglc）均為本課題組前期從川麥冬藥材中分離得到[1112]，其結構經1HNMR， 13CNMR等手段得以確定，經HPLC歸一化法檢測，純度均≥95%。所用色譜級乙腈和甲醇均購于Fisher Scientific （Fair Lawn，USA），甲酸購于Sigma Aldrich （StLouis，USA），其余試劑均為分析純。

Thermo Fisher DIONEX Ultimate 3000（德國Thermo公司），配有DAD檢測器（德國Thermo公司）、ELSD 6000ES檢測器（美國Alltech公司）、HPLCLTQOrbitrap XL質譜檢測器（德國Thermo公司）；Xcalibur 21工作站（美國Thermo Scientific公司）；變色龍70工作站（美國Thermo Scientific公司）；R200D型電子分析天平（1/10萬，德國Sartorius公司）；MilliQ Synthesis超純水純化系統（美國Millipore公司）；熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；冷凍干燥機（北京惠誠佳儀科技有限公司）等。

2方法

21不同干燥方法下的川麥冬樣品制備

取新鮮川麥冬藥材洗凈擦干，混勻，稱取3份，每份約20 g，分別進行50 ℃烘干、80 ℃烘干干燥和真空冷凍干燥（-70 ℃）。干燥指標：按照2015年版《中國藥典》一部附錄規定的水分測定，樣品連續2次干燥后的質量差異在5 mg以下。①50 ℃烘干：將新鮮川麥冬藥材均勻放在電熱恒溫干燥箱中，50 ℃鼓風干燥； ②80 ℃烘干：將新鮮川麥冬藥材均勻放在電熱恒溫干燥箱中，80 ℃鼓風干燥； ③冷凍干燥：將新鮮川麥冬藥材放入超低溫冰箱中冷凍24 h，再放入冷凍干燥機中，真空度10 Pa，-70 ℃干燥。經準確稱量計算后分別得到10021 1，9206 4，8013 2 g的干燥后藥材，備用。

22不同干燥方法下川麥冬供試液及標準品溶液的制備

將干燥后的麥冬藥材粉碎，分別稱取步驟21項中各干燥品2459 3 g（50 ℃）， 2278 6 g（80 ℃）， 2012 1g（凍干）以及鮮品5014 4 g（注：各藥材取樣量按照干燥得率計算，誤差均嚴格控制在1%以內，以消除取樣誤差對峰面積差異的影響），加70%甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過，50 ℃水浴蒸至近干，加水2 mL使溶解，通過預平衡過的SPE（Solid Phase Extraction）固相萃取C18Low小柱（1667 g·L-150 pk，美國Grace公司），分別以2 mL水、2 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，以022 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

分別取上述各對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解至01 g·L-1作為儲備液，進樣前適當稀釋后使用。

23液相色譜條件

色譜柱ZorbaxSBAq C18色譜柱（46 mm×150 mm，35 μm）；流動相A 為01%甲酸水溶液，流動相B為乙腈甲醇（3∶1）；梯度洗脫：0～3 min，5%～10% B；3～6 min，10%～21% B；6～18 min，21%～26% B；18～40 min，26%～51% B；40～58 min，51%～55% B；58～60 min，55%～72% B；流速10 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量5 μL，DAD檢測波長296 nm；ELSD檢測器：漂移管溫度100 ℃，載氣流速27 L·min-1。

24質譜條件

電噴霧離子源負離子檢測模式，毛細管電壓30 V，噴霧電壓30 kV，毛細管溫度350 ℃，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb，CID碰撞能量35%。一級掃描分辨率為FWMH 3萬；掃描范圍為m/z 100～1 500。流動相采用柱后分流方式，進入DAD檢測器和質譜檢測器的流動相流速為030 mL·min-1，剩余的流動相進入ELSD檢測器。

3結果與分析

31麥冬藥材供試樣品的提取方法優選

實驗分別考察了提取溶劑、溶劑倍量以及提取時間對川麥冬中主要成分高異黃酮和甾體皂苷提取率的影響，最終確定以25 mL 70%甲醇超聲提取30 min的供試樣品溶液制備方法。

由于麥冬藥材中含有大量的糖類成分，借助于SPE固相萃取不僅可以實現對選擇性高的提取、分離、濃縮三位一體的過程，而且可以從供試樣品中除去對麥冬固有成分分析有干擾的糖類物質。因此，本實驗進一步采用SPE固相萃取法進行供試樣品的制備，基于對糖的去除和目標成分的保留效果，最終優選了SPE固相萃取處理方法。

32不同干燥方法下川麥冬HPLCMS分析條件的優選

實驗中分別考察了流動相種類、流速、柱溫、洗脫梯度等對川麥冬中高異黃酮和甾體皂苷類成分的分離效果，得到不同干燥方法及鮮品川麥冬藥材的HPLCDAD，HPLCELSD特征圖譜，見圖1，2。同時，優選了LTQOrbitrap高分辨質譜的分析條件，從而為后續的差異性成分結構鑒定提供依據。

33不同干燥方法下川麥冬藥材差異色譜峰的篩選

川麥冬鮮品與各干燥品均平行測定3次，采用自動積分的方法分別對4種不同樣品色譜圖中的各色譜峰進行積分，并利用變色龍數據處理平臺進行色譜峰面積歸一化處理，根據各成分在檢測器中的響應值，建立tRS（tR：保留時間；S：峰面積）數據集。每個保留時間tR下的色譜峰面積S取3次測定結果的平均值，以新鮮川麥冬藥材中的色譜信息作為參照，計算峰面積差異率ω（%）。

ω=|Sx-Sy|/Sx×100%

Sx為tR下新品峰面積平均值；Sy為tR下干燥品峰面積平均值。

由此，篩選出ω≥10%的色譜峰，標注為差異色譜峰。結果，共篩選出36個差異色譜峰，其中HPLCDAD檢測結果中有20個，見圖1；HPLCELSD檢測結果中有16個，見圖2。

從上述特征圖譜中可以發現，不同干燥方法對川麥冬固有成分有顯著影響。無論是DAD還是ELSD檢測結果，各干燥品在色譜峰數量和峰面積上有較大差異：與川麥冬鮮品相比，50 ℃烘干樣品的色譜吸收峰數目與鮮品相當，且各吸收峰的峰面積也最為相近；80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥色譜吸收峰偏少，且峰面積與鮮品相比差異較大。這表明，在50 ℃烘干條件下川麥冬藥材不僅能夠較快地得以干燥，且不易發生固有化學成分的轉化。

34相關差異性成分的HPLCLTQOrbitrap結構鑒定

甾體皂苷和高異黃酮類化合物是川麥冬的特征性成分，其基本裂解規律的相關研究已較為深入[1317]，可以為甾體皂苷和高異黃酮類差異性成分的結構鑒定提供借鑒。

341高異黃酮類化合物的結構鑒定通過查閱文獻并結合對照品裂解方式發現，高異黃酮與普通黃酮類化合物裂解途徑有顯著的差別。高異黃酮類化合物一般有2條裂解途徑： ①一般脫去B環+甲基，產生A環+C環的碎片信息。如化合物27，在負離子模式下，其準分子離子峰m/z 327086 5 [M-H]-（C18H15O6，誤差04），在其二級質譜裂解過程中會脫去m/z 121，產生m/z 206 [M-H-C7H6O-CH3]-的碎片離子； ②只脫去B環，產生A環+C環+甲基的碎片信息。例如，化合物14，其準分子離子峰m/z 299092 5 [M-H]- （C17H15O5，誤差26），在其進一步的二級質譜裂解過程中，能夠產生m/z 203 [M-H-C6H7O]-的特征碎片離子。應用HPLCDADMSn技術，本研究從用不同干燥方法得到的麥冬藥材中共鑒定了13個差異性高異黃酮類成分。其中，通過與對照品比對準確鑒定了6個化合物的結構，并結合保留時間、質譜裂解規律以及相關文獻報道對其余7個化合物的結構進行了推測，見表1。

342甾體皂苷類化合物的結構鑒定甾體皂苷類化學成分是川麥冬的另一類特征性化學成分。在負離子模式下，甾體皂苷類成分的ESIMS 譜主要生成 [M-H]-及[M+HCOO]- 的準分子離子峰。

而它們的多級質譜裂解途徑也非常相似，均表現為一系列糖殘基（葡萄糖、鼠李糖、木糖、巖藻糖、阿拉伯糖等）的中性丟失，而且不同糖基的裂解順序也不同。其中，對于糖鏈部分有乙?；〈幕衔?，其[M-H]-準分子離子峰在ESIMSn譜中會產生丟失乙烯酮基的特征碎片，此外還常能檢測到[M-H-CH2CO-H2O]-的離子碎片。本研究應用HPLCELSDMSn從用不同干燥方法得到的川麥冬中共篩選了11個差異性甾體皂苷類成分。根據上述規律，通過與對照品比對保留時間以及多級質譜數據準確鑒定了5個甾體皂苷的結構，并對剩余的6個甾體皂苷類成分的結構進行了推斷[1821]，見表1。

343其他未被鑒定的差異性成分本實驗中有12個差異色譜峰未進行鑒定：有1個差異峰只有色譜信息，缺乏準確的質譜信息；7個差異峰雖然有質譜信息但未獲得其多級信息；4個差異峰雖然色譜、質譜信息完整，但是未見文獻報道，后續研究中將對這些成分進行研究。

4討論

麥冬中的兩大類特征性成分甾體皂苷和高異黃酮分別在ELSD和DAD檢測器上有較好的響應，因此本研究建立了HPLCDADELSD多檢測器串聯的分析方法。例如，利用 DAD檢測器進行全波長掃描分析，表明296 nm下高異黃酮類化學成分的色譜峰信息豐富且分離度良好；當ELSD檢測器的漂移管溫度為100 ℃，載氣流速為27 L·min-1時，甾體皂苷類化學成分能夠有較好的響應值。在此實驗條件下，由于大部分色譜峰都可獲得良好的分離度，可以實現以上兩大類化學成分的同時定性和半定量分析。同時，HPLCLTQOrbitrap高分辨液質聯用儀具有高分離度、高靈敏度和高選擇性的優點，并能夠提供精確的化合物相對分子質量信息，可以為本實驗中麥冬差異性成分結構的鑒定提供有力的技術支撐。

本實驗考察了50 ℃烘干干燥、80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥3 種方式對麥冬品質的影響。對比多檢測器串聯得到的色譜峰信息可以發現，不同的麥冬干燥方法對川麥冬固有化學成分有顯著的影響。其中，50 ℃烘干干燥更有利于麥冬藥材中化學成分的保留，可作為麥冬藥材適宜的產地干燥加工方法。同時，根據高分辨質譜儀提供的碎片信息，從不同干燥方法得到的麥冬藥材中篩選了36個差異性成分，并鑒定了24個差異性化合物，包括11個甾體皂苷和13個高異黃酮類成分。其中，川麥冬中甾體皂苷類在50 ℃烘干條件下損失的量要比80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥低，在采用80 ℃干燥時，該類成分的含量明顯下降，變化率大多在25%以上，可能是由于皂苷類成分在高溫下容易分解[2223]；而在-70 ℃冷凍干燥條件下，皂苷類成分也容易發生轉變，與人參皂苷、梔子苷等化學成分的轉變趨勢基本一致[22，24]。另外，根據DAD結果還發現，發生轉變的高異黃酮類成分主要為二氫高異黃酮，僅有1個高異黃酮（11號峰），可能與高異黃酮具有相對完整的共軛體系有關；當化合物結構中存在醛基時，在80 ℃烘干干燥和-70 ℃冷凍干燥條件下，化合物的穩定性較差，容易發生成分的轉變（如：25號峰和36號峰）。

因此，本研究基本闡明了川麥冬在不同干燥過程中的甾體皂苷和高異黃酮類化學成分的變化，可為建立適宜的麥冬藥材產地干燥加工方法提供科學依據。

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[責任編輯丁廣治]