油橄欖果渣多酚分離純化及抗氧化活性

謝碧秀 +馬建英 +楊澤身+向亞楠 陳明霜

摘要：研究了6種大孔樹脂對油橄欖果渣多酚的吸附性能，篩選出最佳樹脂為XAD-16，進一步對油橄欖果渣多酚的分離純化工藝進行了優化。最佳工藝為pH值4的油橄欖果渣多酚提取液濃度為0.3 mg/mL，上樣流速為 2 BV/h，洗脫劑乙醇體積分數為80%，洗脫量為3 BV。對純化后的油橄欖果渣多酚抗氧化活性進行了研究，結果表明，油橄欖果渣多酚具有較強的還原能力，對超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽具有良好的清除能力。

關鍵詞：油橄欖果渣；多酚；純化；抗氧化

中圖分類號：TS201.2文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）05-0178-05

油橄欖（Olea europaea L.）主產地中海區域，為著名亞熱帶木本油料兼果用樹種，栽培品種含豐富優質食用植物油——橄欖油[1]，享有植物油皇后的美譽[2]。自20世紀60年代起，油橄欖開始在中國引種，其中，甘肅省隴南市武都區是目前全國最大的油橄欖種植基地[3]。油橄欖榨油后的果渣、廢水等生產副產物雖然富含多酚、苦苷等活性物質，但綜合利用還有待開發。多酚類化合物廣泛存在于許多植物中，研究證實，油橄欖多酚對DPPH自由基和羥基自由基都具有一定的清除能力[4-5]。國內關于油橄欖果渣、葉片、果實中多酚提取方法的研究已有較多報道[4-10]，但很少看到關于油橄欖果渣中多酚類物質分離純化的報道。在前期油橄欖多酚提取方法研究的基礎上，使用大孔樹脂對提取液進行了分離純化，進一步分析了油橄欖果渣多酚的抗氧化活性。

1材料與方法

1.1試驗材料

油橄欖果渣由涼山州中澤新技術開發有限責任公司提供，果實經榨油脫水后產生的果渣立即裝袋，真空包裝，-20 ℃ 條件下保藏備用。

1.2試劑與儀器

試劑：蒸餾水；正己烷、無水乙醇、碳酸鈉、Folin-Ciocalteu 試劑等均為分析純，四川成都市科龍化工試劑廠；沒食子酸標品，中國醫藥上?；瘜W試劑公司；大孔吸附樹脂XAD-7HP、XAD-16，羅門哈斯公司；大孔吸附樹脂AB-8、HPD-200、HP-20、D101，四川成都市科龍化工試劑廠。

儀器：UV-18000紫外可見分光光度儀，翱藝儀器（上海）有限公司；SB-5200超聲波清洗儀，寧波新藝生物科技股份有限公司；ATL-124分析天平，德國賽多利斯集團；DUG-924GA電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；RE-6000A旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；玻璃層析柱，16 mm×30 mm；HL-2恒流泵，上海青浦滬西儀器廠。[LM]

1.3試驗方法

1.3.1多酚提取濃縮物的制備

精確稱取10 g經解凍后的果渣，以80%乙醇，料液比1 ∶[KG-*3]24，在250 W、50 ℃的水浴中超聲45 min，收集上清液，于40 ℃下旋轉蒸發除去溶劑得到棕紅色的粗提液；將粗提液用25 mL正己烷萃取2次，正己烷層濃縮，回收正己烷，得油橄欖果渣提取物精制產品，并于 -20 ℃ 條件下保存備用。

1.3.2多酚含量測定

采用Folin-Cilcalteu比色法[11]在765 nm波長處測定不同濃度的沒食子酸標準溶液的吸光值，以吸光度值（y）為縱坐標，標準溶液濃度（x）為橫坐標，得到回歸方程式y=5.169 7x（r2=0.999 0），沒食子酸標品在0～0.275 mg/mL濃度范圍內與吸光度呈良好線性關系。以試樣替代沒食子酸溶液測定吸光值，根據繪制的標準曲線方程計算多酚含量（以沒食子酸計）。

1.3.3樹脂篩選

通過測定7種樹脂的吸附和解吸能力確定最佳樹脂。準確稱取經預處理，并經濾紙吸干后的6種樹脂各2.000 g，分別置于250 mL具塞磨口三角瓶中，加入濃度為0.25 mg/mL的多酚粗提液40 mL，水浴振蕩，（25 ℃、120 r/min）24 h后，過濾取上清液測定濾液體積和多酚的濃度，計算吸附率。將濾出的樹脂加入80%的乙醇40 mL繼續振蕩8 h，計算解吸率。

1.3.5吸附動態試驗

1.3.5.1pH值對吸附的影響

將最佳大孔樹脂濕法裝入5根相同型號的層析柱中，柱體積10 mL。將20 mL濃度為 0.25 mg/mL 的多酚提取液在pH值分別為3、4、5、6、7的條件下上柱，上柱速率為2 BV/h，以確定最佳pH值。

1.3.5.2上樣流速對吸附的影響

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱。然后將濃度為0.25 mg/mL、pH值4的多酚提取液20 mL用恒流泵分別以1、2、3、4、5 BV/h的速率上柱吸附，以確定最佳上樣流速。

1.3.5.3上樣濃度對吸附的影響

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱。分別用20 mL pH值4，濃度分別為0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的多酚提取液上柱，流速為3 BV/h，以確定最佳上樣濃度。

1.3.6解析動態試驗

1.3.6.1乙醇濃度對洗脫效果的影響

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱，按優選吸附條件進行上樣吸附，收集流出液并測多酚含量；蒸餾水淋洗，然后分別用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，以3 BV/h的流速進行洗脫，洗脫體積為3 BV，以確定乙醇的最佳洗脫濃度。

1.3.6.2洗脫劑體積對洗脫效果的影響

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱，按優選吸附條件進行上樣吸附，收集流出液并測多酚含量；蒸餾水淋洗，80%乙醇分別以1、2、3、4、5 BV 的量進行洗脫，以確定乙醇洗脫的最佳體積。

1.3.6.3動態洗脫曲線的繪制

取10 mL處理過的大孔樹脂濕法裝柱，將20 mL多酚提取液按優選吸附條件上柱吸附，再用蒸餾水淋洗樹脂，用80%乙醇以3 BV/h的速率洗脫，收集洗脫液每2 mL測1次多酚濃度，繪制動態洗脫曲線。

1.3.7抗氧化活性測定

1.3.7.1還原力的測定[12]

在2.5 mL pH值6.6磷酸鹽緩沖液中加入不同濃度的試樣溶液2.5 mL，1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合物在50 ℃恒溫20 min后，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，然后以3 000 r/min離心分離10 min，取上清液5 mL加蒸餾水5 mL、0.1% FeCl3溶液1 mL，在700 nm處測定吸光度。以蒸餾水為無還原能力對照，維生素C、BHT作為還原能力對照。

1.3.7.2對超氧陰離子自由基（ O-2[KG-*2]· [KG-*3]）的清除作用[13]

取4.5 mLTris-HC1緩沖溶液，于25 ℃水浴中放置20 min，分別加入1 mL不同濃度的試驗溶液和0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應5 min，然后加入 8 mmol/L 的HCl溶液1 mL終止反應，然后在420 nm處測定吸光度D1，空白以蒸餾水代替樣品液，測定吸光度D0。按下式計算清除率：

[JZ] O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率=（D0-D1）/D0×100%。

1.3.7.3橄欖多酚提取物亞硝酸鹽（NO2-）的清除作用[14-15]

取不同濃度的樣品液3 mL于具塞試管中，用pH值3.0的檸檬酸緩沖液定溶至5 mL，然后每管中加入 5 μg/mL 亞硝酸鈉1 mL，混勻，立即置于37 ℃水浴中保溫 1 h，隨后立即向各反應管加入0.4%的對氨基苯磺酸1 mL，混勻，靜置5 min；再向各管加入0.2%的鹽酸萘乙二胺顯色劑0.5 mL，搖勻，定容至10 mL，靜置15 min。每樣品管同時做不加亞硝酸鈉的本色管（空白管），并做亞硝酸鈉的標準管（不加樣品，其余相同），分別測各管在538 nm處的吸光度D值。按下式計算清除率：

[JZ]NaNO2清除率=[D標-（D樣-D空）]/D標×100%。

式中：D標為不加待測樣只加了NaNO2標準液和其他試劑的反應管光密度；

D樣為既加待測樣又加了NaNO2標準液和其他試劑的反應管光密度；

D空為只加待測樣和其他試劑不加NaNO2標準液的的反應管光密度。

以上試驗，每個試樣做3次平行。

2結果與分析

2.1樹脂的篩選

大孔吸附樹脂的吸附實質為一種物體高度分散或表面分子受作用力不均等而產生的表面吸附現象，這種吸附性能是由于范德華引力或生成氫鍵的結果；同時由于大孔吸附樹脂的多孔性結構使其對分子大小不同的物質具有篩選作用[16-17]，酚類化合物的分子中含有多個酚羥基，分子極性并不太高，因此在弱極性和非極性樹脂上吸附的效果更好[18]。從圖1可以看出，D101吸附率最低；HPD-200雖然吸附率最高，但解吸率卻最低；HP-20吸附率第2，解吸率是倒數第2；XAD-7HP、XAD-16、AB-8的吸附率都較高，其中以 XAD-16最高，所以選XAD-16為最佳吸附樹脂。

2.2最佳大孔樹脂的靜態吸附與解析曲線

可以看出，XAD-16樹脂對油橄欖果渣多酚的靜態吸附率隨著吸附時間的延長而提高，1 h時的吸附率即可達到78.94%，表明XAD-16的吸附效率高。

可以看出，在0.5 h的解吸時間內，多酚解吸率迅速達到84.64%，超過2 h后，隨著吸附時間的延長，解吸率變化趨于平緩，表明80%的乙醇溶液經過2 h就能把油橄欖果渣多酚很好地從大孔樹脂XAD-16中解吸出來，解吸時間短，解吸率高，最高可達88.45%。

2.3吸附動態試驗

2.3.1pH值對吸附的影響

pH值對物質吸附的影響主要取決于化合物的酸堿度，酸性化合物在酸性溶液中易被吸附，堿性化合物在堿性條件下易被吸附[19]。從圖4可以看出，隨著pH值的升高，XAD-16樹脂對油橄欖果渣多酚的吸附率呈現先升高后下降的趨勢，并在pH值為4時達到最大值。這可能與多酚類物質屬于帶羥基的多元酚酸類有關，在微酸性環境下，酚類物質的結構不易被破壞，以分子態存在，易于被識別并吸附[20]；在溶液pH值較高條件下，多酚化合物的酚羥基會解離形成H+，并產生相應的陰離子，進而削弱溶液中氫鍵間的相互作用力，最終導致樹脂的吸附能力隨之下降[14]。因此，樣液的pH值調為4最佳。

[FK（W11][TPXBX4.tif][FK）]

2.3.2上樣流速對吸附的影響

上樣流速對樹脂吸附的影響主要是溶質向樹脂表面的擴散作用，對于相同濃度的上樣溶液，上樣流速過大，樹脂的吸附率就會降低。上樣流速過小，多酚分子雖然能夠充分與樹脂接觸，但吸附時間太長，不適用于生產。從圖5可以看出，上樣流速越快，XAD-16樹脂對油橄欖果渣多酚的吸附率逐漸降低，在上樣流速為1 BV時，吸附率為98.29%；在上樣流速為2 BV時，吸附率為 98.14%。既要使大孔吸附樹脂的吸附效果好，又要保證較高的工作效率，綜合考慮采用2 BV的上樣流速較為適宜。

2.3.3上樣濃度對吸附的影響

從圖6可以看出，隨著上樣濃度的增加，吸附率隨之升高；當濃度達到0.3 mg/mL時，吸附率達到最高值98.36%；超過0.3 mg/mL濃度后，吸附率稍有下降。根據吸附平衡理論，濃度減小，達到平衡時所需提液體積增大，殘留在流出液中的多酚增多，吸附率降低；濃度過高時，樹脂表面的多酚分子單分子層吸附飽和后，會發生多層吸附，并容易產生絮凝和沉淀，堵塞微孔，降低內孔利用率，吸附率也將下降[19，21]。因此，上樣濃度控制在 0.3 mg/mL 為宜。

2.4解析動態試驗

2.4.1乙醇濃度對洗脫效果的影響

從圖7可以看出，在一

定范圍內，隨著乙醇濃度的增加，樹脂對油橄欖果渣多酚的解吸率逐漸提高，當乙醇濃度為80%時，解吸率達到最大值 97.82%，繼續提高乙醇的濃度，解吸率反而有所下降。因為乙醇濃度過低時，解吸液的極性較高，不僅不能破壞樹脂與多酚間形成的氫鍵，而且多酚在解吸液中的溶解性低，解吸率也低；當乙醇濃度過高時，油橄欖果渣多酚提取液中的大分子物質沉淀會使樹脂中多酚分子擴散困難，同時水溶性多酚的溶解量降低而導致解吸率降低。因而選用80%的乙醇溶液進行洗脫。

2.4.2洗脫劑的體積對洗脫效果的影響

洗脫劑乙醇體積對油橄欖果渣多酚洗脫效果的影響見圖8。從圖8可以看出，隨著乙醇用量的增加，多酚的解吸率也隨之增加，在洗脫體積為3 BV后效果增加不明顯。綜合考慮選擇洗脫劑乙醇的用量為3 BV為宜。

2.4.3動態洗脫曲線的繪制

XAD-16樹脂的動態洗脫曲線見。油橄欖果渣多酚洗脫峰相對集中，較容易洗脫。流出液體積達到4 mL時開始有多酚流出；隨著流出液體積增加，洗脫液中多酚濃度快速上升，當流出液體積達到8 mL左右，多酚濃度達到最大值0.58 mg/mL；隨后流出液體積再增加，多酚濃度降低。當洗脫液達30 mL時，洗脫基本完成，因此，選用3 BV的洗脫體積，可使洗脫液中的多酚含量達到最大。

2.5抗氧化活性測定

2.5.1還原力的測定

多數非酶類抗氧化劑是通過還原反應終止氧化鏈式反應的，所以，化合物的還原能力是顯示其是否具有抗氧化潛能的重要因素[14]。由K3Fe（CN）6反應成K4Fe（CN）6，并進一步生成Fe4[Fe（CN）6]3，這是一有色反應的過程，在700 nm波長處有最大吸收峰，吸光度越大則樣品的還原力越強[22]。油橄欖果渣多酚與維生素C、BHT還原力的比較見圖10。從圖10可以看出，在試驗濃度范圍內，試樣的還原力隨著濃度的增加均呈上升變化趨勢；油橄欖果渣多酚的還原力低于維生素C，高于BHT，表明油橄欖果渣多酚具有較強的還原能力。

超氧陰離子自由基是生物體內氧代謝首先形成的自由基，是所有氧自由基的前身，在某些病理情況下，機體內 O-2[KG-*2]· [KG-*3]產生過多或清除能力減弱，使體內 O-2[KG-*2]· [KG-*3]濃度升高，就會產生氧化損傷而誘發多種疾病[23]，因此，在檢驗物質的抗氧化活性時常把清除超氧陰離子自由基作為重要指標之一。以維生素C、BHT為對照，測定油橄欖多酚對超氧陰離子自由基的清除率見圖11。油橄欖果渣多酚對超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，但其清除能力比維生素C、BHT的要弱。當濃度為0.1～0.3 mg/mL時，油橄欖果渣多酚對超氧陰離子自由基的清除率從5.17%迅速增至51.86%，隨后隨著樣品濃度的繼續增加而清除率變化幅度不大，在濃度為0.5 mg/mL時清除率達到最大值63.64%。

2.5.3油橄欖多酚提取物亞硝酸鹽（NO2-）的清除作用

N-[CM（24*5]亞硝基化合物是一種具有強烈致癌作用的化合物，其前

提物質廣泛存在于食品中以及產生于食物在體內的代謝中，硝酸鹽或亞硝酸鹽和胺類可在體內合成亞硝胺，尤其在胃液中更易合成[24]，是誘發胃癌的重要因素。以維生素C、BHT為對照，研究油橄欖多酚對亞硝酸鹽的清除作用，試驗結果見圖12。在同樣濃度條件下，油橄欖果渣多酚對于亞硝酸鹽的清除能力低于維生素C、BHT。在試驗濃度范圍內，油橄欖果渣多酚對亞硝酸鹽的清除作用隨著試樣濃度的增加而提高，清除率最大值為濃度在0.5 mg/mL時的52.27%。

3結論

通過對6種大孔樹脂吸附分離性能的考察，篩選出最佳樹脂為XAD-16。進一步對油橄欖果渣多酚的分離純化工藝進行了優化：上柱條件為油橄欖果渣多酚提取液濃度 0.3 mg/mL，最佳pH值為4，上樣流速為2 BV/h。解吸條件為洗脫劑乙醇體積分數80%，洗脫量為3 BV。采用大孔樹脂分離油橄欖果渣多酚具有吸附容量大、選擇性好、易于解吸、機械強度高、再生處理簡單、操作簡單、得率恒定、產品質量穩定、成本低等特點。

在試驗濃度范圍內，油橄欖果渣多酚具有良好的抗氧化能力，其還原力低于維生素C，高于BHT；油橄欖果渣多酚濃度在0.5 mg/mL時對超氧陰離子自由基、亞硝酸鹽的清除率分別為63.64%、52.27%，表現出良好的清除效果。

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