α-淀粉酶的研究與應用進展

李文釗，臧傳剛，李義，陶進，潘忠，許克家，梁穎超，佟毅＊

（1. 吉林中糧生化有限公司（玉米深加工國家工程研究中心），吉林 長春 130033; 2. 中糧營養健康研究院，北京 昌平 102209）

α-淀粉酶的研究與應用進展

李文釗1,2，臧傳剛2，李義1，陶進1，潘忠2，許克家2，梁穎超1，佟毅1＊

（1. 吉林中糧生化有限公司（玉米深加工國家工程研究中心），吉林 長春 130033; 2. 中糧營養健康研究院，北京 昌平 102209）

α-淀粉酶是一種重要的淀粉水解酶，它能夠切斷淀粉內部的糖苷鍵，產生糊精、低聚糖和葡萄糖等。α-淀粉酶可以從植物、動物或微生物中獲得，但工業應用中的α-淀粉酶絕大多數來自細菌和真菌。不同來源的淀粉酶活力和熱穩定性有很大差異，其中嗜熱淀粉酶在實際應用中非常重要和廣泛。α-淀粉酶的制備工藝可以采用深層發酵或固態發酵的方法。目前α-淀粉酶已廣泛應用于食品、紡織、造紙、洗滌劑工業，用于生產麥芽糊精，淀粉改性，葡萄糖、果糖的制備，燃料乙醇的生產等等。主要闡釋α-淀粉酶的性質、制備、純化、表征以及在工業中的應用。

α-淀粉酶；微生物法制備；熱穩定性；應用

淀粉是人們膳食結構中最重要的組成部分，主要來源有玉米、小麥、大米、馬鈴薯和木薯等。淀粉除了可以直接加工成各種食品，還可作為原料，利用化學法或酶法來水解，從而獲得葡萄糖、果糖、麥芽糖糊精及衍生物等產品。淀粉水解后產生的葡萄糖還可以繼續發酵用于生產乙醇以及制備其他衍生物[1,2]。淀粉包含直鏈淀粉和支鏈淀粉，不同來源的淀粉中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量不相同，一般來講，直鏈淀粉約占淀粉的20%～25%，它是由葡萄糖單元通過α-1，4-糖苷鍵結合而成的線性聚合物，溶于熱水但不成糊狀，遇碘變藍。支鏈淀粉占淀粉的 75%～80%，葡萄糖單元除了通過α-1,4-糖苷鍵線性連接，平均每15-45個葡萄糖單位會有分支出現，分支以α-1,6-糖苷鍵連接，支鏈淀粉與熱水作用會膨脹成糊狀，遇碘呈紫或紫紅色。隨著工藝的提高和新型淀粉酶的開發利用，酸法等傳統淀粉水解工藝已慢慢淘汰，而廣泛采取更高效、溫和的酶法生產葡萄糖及果糖等產品。

1 α-淀粉酶的作用

α-淀粉酶（1,4-α-D-葡聚糖水解酶，EC 3.2.1.1）是一種工業中重要的淀粉水解酶，廣泛應用于食品、釀造、制藥和紡織等工業領域，比如用于淀粉液化、紡織物脫漿、造紙工業中的淀粉改性，以及用于釀造、烘焙和洗滌劑等。其中用于淀粉轉化領域的酶制劑銷量占全世界酶制劑銷售總量的10%～15%[3]。α-淀粉酶能切割淀粉、糖原或多糖的內部α-1,4糖苷鍵，產生短鏈糊精、寡糖、葡萄糖和麥芽糖等產物，該過程使淀粉黏度迅速降低，在工業應用中也稱α-淀粉酶為“液化酶”。α-淀粉酶是一種金屬酶，不同來源的酶含有1個到10個不等的Ca2+，Ca2+對α-淀粉酶維持活力和熱穩定性有重要作用[4]。最早使用的商品化α-淀粉酶來自地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的α-淀粉酶，稱作Termamy1，Termamy1和很多高效的α-淀粉酶的活性都需 Ca2+使蛋白保持適當的構象，從而維持其最大的活性和穩定性。除了 Ca2+外，其他的離子比如Mg2+、Na+、Cl-等對α-淀粉酶的結構和功能也有重要作用，比如芽孢桿菌菌株 KSM-K38產生的淀粉酶就是靠Na+來保持其結構和功能[5]。水解酶有內切水解酶和外切水解酶2種類型，內切水解酶作用于底物分子內部，而外切水解酶作用于非還原末端[6]，α端的葡萄糖殘基以及α-1,6-糖苷鍵不能被α-淀粉酶水解。一般α-淀粉酶在pH=5.5～8.0時酶活性較穩定，當然也有例外，比如黑曲酶生產的α-淀粉酶最適合的pH值為4。

2 α-淀粉酶的來源

α-淀粉酶可以從植物、動物或微生物中分離提取得到。不同來源的α-淀粉酶功能相似，但在最適溫度、pH等應用條件上有差異，比如從木薯粉碎后的廢液中分離的α-淀粉酶較其他淀粉酶適用的 pH和溫度范圍都很廣[7]。

目前，α-淀粉酶在商品化制備方面基本都是通過微生物法進行的，這主要有兩個方面原因：一是微生物的生長速度快，酶的生產速度也快，與動物和植物相比微生物更易于操作，微生物培養需要的空間低，投入產出比更高；二是淀粉酶生產菌株可以通過基因工程、誘變、馴化等方式提高酶的生產效率，提高熱穩定性，改良品質等，這對擴展淀粉酶的應用范圍和提高其效率有重要作用。提高熱穩定性是α-淀粉酶菌株篩選的重要工作，一是使菌株更適應工業應用的條件，減少能耗并縮短反應時間；二是當淀粉在較高溫度下進行水解時，D-葡萄糖與異麥芽糖的聚合最小，這樣有利于提高目標產物的得率。

制備商品化的α-淀粉酶的微生物可以是細菌，真菌或基因工程菌等。細菌來源的、使用最廣泛的是來自芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）。其他的也具有產α-淀粉酶能力的菌株有蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等。地衣芽孢桿菌（B.licheniformis），嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus.stearothermophilus）和解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）產生的α-淀粉酶在食品、發酵、紡織和造紙等工業中應用最為廣泛[8]。

熱穩定性對α-淀粉酶的工業應用至關重要，比如在目前的淀粉糖工業制備中，淀粉噴射液化是在高溫（105～118 ℃）條件下進行的，提高酶的熱穩定性一方面可以提高液化溫度，使淀粉液化效果更好，另一方面可以提高產品得率、獲得高附加值產品如葡萄糖、結晶葡萄糖、葡萄糖漿、麥芽糖和麥芽糖糊精等。研究表明，枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B. stearothermophilus）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）和解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）能產生耐熱性能比較好的α-淀粉酶。另外，一些嗜鹽微生物產生的酶能夠耐受高鹽濃度，這類酶可應用于許多使用濃鹽溶液的苛刻的工業過程，而一般的淀粉酶在這些條件下活性會受到嚴重抑制。此外，大多數鹵代細菌產生的酶對高溫具有相當的耐受性，并且可以在長時間內在室溫下保持穩定。研究表明，來自嗜鹽細菌如嗜鉻桿菌（Chromohalobacter spp.），鹵桿菌屬（Halobacillus spp.），鹽單胞菌屬（Haloarcula hispanica，Halomonas meridiana）的微生物能生產較好的嗜酸性淀粉酶[9]。

真菌來源的α-淀粉酶主要來自曲霉屬及少數青霉菌屬。近年來，利用青霉菌（Penicillium fellutanum）深層發酵已被廣泛用于生產α-淀粉酶，青霉菌MT-1（Penicillium expansum MT-1）固態發酵也被用于通過生產α-淀粉酶[10]。淀粉酶固態發酵生產一般使用黃青霉（Penicillium chrysogenum）作為菌株，底物使用玉米芯葉，小麥秸稈和麥麩等[11]。其他的用于生產商品化α-淀粉酶的真菌來源的菌株主要是曲霉屬菌株，比如米曲霉（Aspergillus oryzae），黑曲霉（Aspergillus niger），泡盛曲霉（Aspergillus awamori）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus）等。煙曲霉已經廣泛用于通過深層發酵技術生產酶[12]。

基因工程菌株也被廣泛用于生產α-淀粉酶。研究人員通過對解淀粉芽孢桿菌 UNG-16（B.amyloliquefaciens UNG-16）利用化學誘變劑甲基磺酸乙酰（EMS）以及物理輻射方法進行突變，篩選獲得一株表型較好的突變株，表現出 102.78±2.22 U/ml/min的活性，比親本菌株高出1.4倍[13]。用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍處理枯草芽孢桿菌馬爾堡（B. subtilis Marburg），突變株與親本菌株相比，其中一個突變體YN9的酶的產量增加了三倍[14]。

3 α-淀粉酶的制備

生產商品化α-淀粉酶的大規模發酵制備方法基本分為兩種：深層發酵(Submerged Fermentation，SmF）和固態發酵（Solid State Fermentation，SSF）。深層發酵是α-淀粉酶生產的傳統方法，一般采用糖蜜和肉湯等作為碳源和氮源，發酵產生的次級代謝產物可以直接分泌到發酵液中，但這種方法底物消耗較快，需要在發酵過程中不斷進行流加補充，比較適用于對水分要求較高的微生物菌種[15]。深層發酵方法物料的滅菌和最終產品的純化過程更容易，對溫度、pH值、通氣量、溶氧和水分等過程參數的控制和優化也比較方便。固態發酵則是適用于生長過程中對水分要求較低的微生物發酵，在該方法中通常使用的固體底物是麩、甘蔗渣和紙漿等。這種方法的最大優點是富含營養物質的廢料可以被再度利用。在固態發酵技術中，底物穩定緩慢的消耗，可以利用較長時間，因此在生產工藝上不需要考慮底物持續供給[16]。固態發酵的另一個優點是對設備要求簡單，生產效率更高，產品濃度更高，污水產生較少。由于以上幾個原因，固態發酵被認為是用于商業生產酶的最有潛力的方法。

4 酶活檢測

α-淀粉酶的酶活檢測方法有很多種，一種方法是原理是通過測定其與淀粉作用后釋放的還原糖量來確定，如DNS法、Nelson-Somogyi (NS)法；另一種方法是通過測定淀粉的消耗，即通過測量淀粉-碘絡合物的吸光度來確定水解程度，如碘法。

4.1 DNS法

這種方法利用二硝基水楊酸（DNS）與還原糖發生氧化還原反應，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該反應產物在高溫條件下顯現棕紅色，且在一定濃度范圍內其顏色深淺與還原糖含量成正比，可以用比色法測定還原糖含量。具體實驗操作是，將底物溶液與酶溶液等量混合，隨后50 ℃熱育10 min，向試管中加入DNS試劑，將混合物置于沸水浴5 min。冷卻至室溫后，測定上清液540 nm處的吸光值。在對來自芽孢桿菌菌株 GM8901的嗜堿性α-淀粉酶的研究中，通過 DNS方法測定還原糖進行酶活檢測，孵育后發現其活性最高為0.75 U/mL[17]。

4.2 Nelson-Somogyi (NS)法

NS法也是一種利用顯色反應測定還原糖的方法。具體操作過程是，先將底物溶液均分，在50 ℃下加熱5 min。將預熱（50 ℃，5 min）的酶溶液加入到底物中，該反應混合物在50 ℃下進行10 min，后加入CuSO4試劑終止反應。然后將其在沸水浴中孵育40 min并冷卻至室溫。接著加入鉬酸鹽試劑，并在室溫下孵育10 min。最后加入水，混合物以13 000 r/min離心1 min，測定上清液610 nm處的吸光度[18]。從古細菌天竺葵屬菌株 Ah-36（Natronococcus sp. Strain Ah-36）分離的嗜堿性α-淀粉酶用NS法測定酶活，在孵育35小時結束時酶活為0.01 U/mL， 90 h后最大活性為0.12 U/mL，110 h后仍保持最大活性[19]。

4.3 碘法

直鏈淀粉和支鏈淀粉遇碘顯色不同。α-淀粉酶的水解活性液可以用直鏈淀粉和碘反應形成藍色絡合物的方法來確定。支鏈淀粉遇碘呈現紫紅色。在直鏈淀粉聚合度降低到一定程度時，其與碘的復合物呈紅棕色。

在酶底物反應終止后，可以通過測定其吸光度確定α-淀粉酶水解淀粉的程度。在對嗜熱α-淀粉酶表征的研究中，粗酶樣品在 92 ℃下與可溶性淀粉一起熱育10 min，在冰水中冷卻反應混合物終止反應，在反應混合物中添加碘與淀粉形成有色復合物，用水稀釋后，使顏色達到可以在600 nm讀取的可測量的范圍[20]，通過此操作可以準確測量酶活。

5 α-淀粉酶的純化和表征

為了節約生產成本，工業應用的酶制劑較少進行下游處理，通常使用的是粗制品。而在臨床和制藥行業，以及當用于研究結構功能關系和生物化學性質時，酶必須進行高度純化。酶蛋白的純化，通常使用的方法是沉淀，色譜分離，萃取，具體使用那種方法取決于需要純化的酶的性質，要實現高純度酶的制備一般會采用上述方法的組合，純化所涉及的步驟數將取決于所需的純度程度[21,22]。如果是胞外分泌的酶，可以通過過濾和離心的方法獲得；如果是胞內酶，可以通過加入生玉米淀粉，然后過濾分離。粗淀粉酶一般先用硫酸銨或有機溶劑進行沉淀，沉淀后的樣品可以用水或緩沖液進行透析進一步濃縮，接著可以使用色譜技術，如離子交換、凝膠過濾和親和層析等進一步分離和純化酶。

在一個黃曲霉（Aspergillus falvus var.）生產的酶的研究中，研究人員首先是將蛋白沉淀，然后進行透析，然后用柱色譜法獲得了較純的蛋白[23]。在另外一項研究中，研究人員首先使用三氯乙酸（TCA）和丙酮沉淀蛋白樣品，再用凝膠過濾柱過濾，過濾液進一步利用離子交換柱純化，最終獲得較高純化的蛋白樣品[24]。在對來自產氣莢膜梭菌A（Clostridium perfringens Type A）的細胞外α-淀粉酶的純化和表征的研究中，是通過聚乙二醇沉淀，先制備粗酶濃縮物，然后將該濃縮樣品通過色譜柱分離，可以看到有三個不同的淀粉分解的峰，然后分別收集來自單峰的組分，并繼續進行色譜分離，然后在Sephacryl S-100 HR柱上分離獲得高純度蛋白[25]。純化由海棲熱袍菌 MSB（Thermotoga maritima MSB8）產生的α-淀粉酶，破碎后的沉淀用陰離子交換層析蛋白，接著用蛋白電泳鑒定下純度，最后再經過一些列色譜柱等進行純化[26]。

酶在完成表達和純化后需要進一步表征和鑒定，最常用的，也是最快速和直接的是通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的方法來表征。蛋白加熱后會變性，使用染色劑（如考馬斯亮藍或硝酸銀）對蛋白進行染色，然后在凝膠上把分子標簽蛋白和樣本同時電泳，通過比對可以判斷目的蛋白的分子量，也可判定所得酶的純度和均一性[27]。例如，由牛鏈球菌148（Streptococcus bovis 148）表達的胞內α-淀粉酶，分離純化后，其電泳凝膠上出現單條帶，這表明分離純化步驟的效果很好，而且通過與標簽比較可以確定純化后的分子量，從而確定細胞內的α-淀粉酶以單體形式存在[28]。

6 α-淀粉酶的工業應用

α-淀粉酶由于其在淀粉水解上優良的性能，在工業的很多領域有諸多應用。使用淀粉酶對環境的污染少，工藝操作更簡單，已經取代了很多工業產品制造中的常使用的化學水解方法?，F將α-淀粉酶的工業應用總結如下：

6.1 果葡糖漿生產

α-淀粉酶廣泛用于水解淀粉轉化成為其他高附加值的產品，如用于生產果糖以及果葡糖漿。果葡糖漿的生產過程一般包括以下幾個步驟：淀粉液化、糖化和葡萄糖異構化。在工業生產中，首先是調漿，使淀粉顆粒溶解在水中形成粘性淀粉懸浮液，接著通過α-淀粉酶部分水解淀粉形成短鏈糊精，降低淀粉懸浮液粘度使淀粉液化。糖化是進一步水解淀粉生產葡萄糖，利用糖化酶從非還原末端切割α-1,4糖苷鍵，產生高葡萄糖漿。然后通過葡萄糖異構酶催化的異構化將該高糖漿轉化為高果糖糖漿。所獲得的葡萄糖和果糖混合的果葡糖漿用作甜味劑，廣泛用于食品領域特別是在飲料工業中[21,29]。

6.2 烘焙業

在面包烘烤過程中將α-淀粉酶加入到面團中，可以使淀粉水解成可供進一步由酵母發酵的小糊精，這能提高了發酵速率。此外，淀粉水解降低了面團的粘度，改善了面團質地，增加了面包體積。

淀粉產品烘烤后，進行長期儲存可能會發生一些變化，其中有些不好的變化，如酥皮堅硬度增加，外殼脆度下降，面包屑含水量下降和面包風味喪失等稱為陳化。α-淀粉酶可用作處理這種情況的抗陳化劑，以提高烘焙食品的保質期和柔軟度。

雖然α-淀粉酶具有降低粘性的作用，但過量可能會導致面包的粘性增加，是由于分支糊精導致的。在這種情況下，支鏈淀粉酶與淀粉酶組合使用，可以使淀粉酶處理過的面包的粘性的化合物的特異性水解[30]。

6.3 洗滌劑業

隨著餐具洗滌和洗衣方式的改進，洗滌劑中酶的使用越來越普遍，使用量也持續增加。早期洗滌劑中普遍添加的是化學物質，對人體可能有害，且對金屬和木質餐具也會造成損害，使得洗碗條件變得苛刻。相比較而言，不論對環境還是對人體，酶使用起來更安全，且酶的使用條件更溫和，適合常溫條件下的使用，這更符合人們使用的習慣，使得酶制劑在洗滌劑中得到了廣泛開發和應用。

對于衣服污漬而言，很多淀粉加工類食物殘留，如糕點等，粘在衣服上的淀粉污物還能吸附灰層、土壤顆粒使衣服更易臟。α-淀粉酶可以將含淀粉的食物顆粒消化成較小的水溶性寡糖，用水沖洗后達到去除污漬的目的。此外，α-淀粉酶在低溫和堿性pH下的穩定性很高，有助于其在洗滌劑開發中適應更廣泛應用條件。

目前90%的液體除垢劑中都含有α-淀粉酶，且自動洗碗機的除垢劑對α-淀粉酶的需求也在不斷增長。使用α-淀粉酶的缺點是淀粉酶的對金屬離子的依賴如Ca2+，在低Ca2+環境下穩定性可能較差，此外α-淀粉酶還對氧化劑敏感，這些缺點可以通過使用基因改造菌株產生的α-淀粉酶克服，著名的酶制劑公司諾維信和杰能科是兩家主要的α-淀粉酶供應商，他們已經通過基因工程改良了淀粉酶的品質，比如他們對地衣芽孢桿菌淀粉酶進行了改造，將197位易被氧化的蛋氨酸突變成亮氨酸，使得淀粉酶對氧化化合物具有更好的耐受性[21]。

6.4 紡織業

在紡織工業中，纖維在制造和編織過程中受到機械處理常常導致經紗斷裂。為了加強螺紋，需要提前在紗線的表面加一層上漿劑，并且在織物編織完成之后去除?？梢猿洚敱Ｗo層的材料其實有很多種，淀粉是最優良的上漿劑，首先它非常容易獲得，其次其價格便宜并且可以很容易從織物中去除。在應用中，在脫漿過程中先利用α-淀粉酶水解淀粉層，將淀粉顆粒降解成易溶于水的糊精，糊精很容易被清洗掉。因淀粉酶只作用于淀粉分子，而不作用于紗線纖維，紡織品的質量不受影響[21]。

6.5 造紙業

在造紙行業中，淀粉通常被用作施膠劑，用于紙張表層處理。天然淀粉粘稠性較高，不適合直接在紙上涂布，一般使用α-淀粉酶先使淀粉部分水解，使其粘度降低，這有利于紙張上漿。α-淀粉酶處理過的淀粉在造紙中的作用有兩方面：一方面防止紙張在加工過程中受到機械損傷，另一方面也有利于改良紙張在強度、光滑度、書寫和擦除等方面的質量[31]。

6.6 燃料乙醇

在燃料乙醇的生產中，首先將原料處理獲得淀粉，原料可以是玉米、木薯、水稻等。接著將淀粉進行液化以形成粘性淀粉懸浮液，在這個過程中，α-淀粉酶主要用于淀粉液化水解，之后是糖化過程，在復合糖化酶的作用下產生葡萄糖，然后這些葡萄糖作為釀酒酵母的底物，經過發酵后產生酒精。在近年來菌株改造的前沿研究中，科研人員把能進行淀粉分解酵母扣囊復膜酵母（Saccharomyces fibuligera）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）進行原生質體融合，經過大量篩選，最終獲得可以直接從淀粉生產乙醇的新酵母菌株，這減少淀粉糖化步驟，是一個非常具有潛力的技術[32]。

7 總 結

隨著社會進步，環境保護標準的提高，以及可持續發展理念的重視，生物酶的應用更加廣泛。α-淀粉酶在以淀粉為原材料的工業中將持續發揮重要作用，包括淀粉深加工行業、洗滌劑業、紡織業、烘焙食品以及生物燃料等。通過菌株篩選或基因工程改造獲得熱穩定性更好、生產性能更高的淀粉酶生產菌株仍然是基礎和重要的工作，提升蛋白純化技術將有利于將淀粉酶應用拓展到藥物和臨床領域。生產成本的降低和應用領域的拓展，將使α-淀粉酶發揮更大作用。

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Research and Application Progress of α-Amylase

LI Wen-zhao1,2, ZANG Chuan-gang2, LI Yi1, TAO Jin1, PAN Zhong2, XV Ke-jia2, LIANG Ying-chao1, TONG Yi1*
（1. Jilin COFCO Biochemical Co., Ltd. , National Engineering Research Center of Corn Deep Processing, Jilin Changchun 130033,China； 2. COFCO Nutrition and Health Institute, Beijing 102209, China）

α-Amylase is a hydrolase enzyme that can catalyse the hydrolysis of internal glycosidic linkages in starch to yield products like dextrins, oligosaccharides or glucose. α-Amylase can be isolated from plants, animals or microorganisms, but α-amylase for commercial application is mainly derived from bacteria or fungi. Thermostability is a desired characteristic for amylase in application, the activity and thermostability of α-amylase from different sources are different. There are mainly two ways for production of α-amylase on commercial scale: submerged fermentation and solid state fermentation. Nowadays, α-amylase has been widely used in the production of maltodextrin, glucose,fructose, starch modification, bakery industry, desizing of textiles, paper industry, detergent industry, fuel ethanol production and so on. In this paper, properties, production methods, purification methods, characterization of α-amylase were introduced as well as its applications.

α-amylase; Microbial production; Thermostability;Application

TQ925+.1

A

1671-0460（2017）11-2292-05

吉林省科技攻關計劃重大科技招標專項，項目號：20150203005NY。

2017-07-11

李文釗（1984-），男，理學博士，2013年畢業于吉林大學，研究方向：生物物理學。E-mail：liwenzhao@cofco.com。

佟毅（1963-），男，博士，教授級高工，研究方向：玉米深加工。E-mail:tongyi@cofco.com。