低氘水對人肺癌細胞A549增殖和分化的影響及機制

戚冰雪，李子宜，叢峰松

(上海交通大學生命科學技術學院，上海200240)

·論著·

低氘水對人肺癌細胞A549增殖和分化的影響及機制

戚冰雪，李子宜，叢峰松

(上海交通大學生命科學技術學院，上海200240)

目的 研究低氘水(DDW)對人肺癌A549細胞增殖和分化的影響，并探討其作用機制。方法 取A549細胞分為觀察組和對照組，分別用氘含量為50 ppm的DDW配制的培養基、正常水配制的培養基培養30 d，倒置顯微鏡下觀察兩組細胞形態，用CCK-8法測定48 h內細胞生長情況。觀察組和對照組細胞先分別在無血清的DDW培養基和正常水培養基中培養48 h使細胞生長同步化，然后分別加入含10%血清的DDW培養基和正常水培養基繼續培養，用碘化丙啶染色和流式細胞分析儀測定兩組36、48 h時處于細胞周期G1、S和G2/M期的細胞比例；取兩組細胞裂解液，抽提細胞總蛋白，Western blot法檢測絲裂原活化的細胞外信號調節激酶(MEK1)、表皮生長因子受體(EGFR)表達，MEK1第217和第298位絲氨酸磷酸化水平，EGFR第1016和第1110位酪氨酸磷酸化水平；比較兩組肺泡Ⅰ型上皮細胞特異性蛋白標志物AQP5、T1a和肺泡Ⅱ型上皮細胞特異性蛋白標志物SPB、SPC1、SPC2、CFTR的表達。結果 對照組細胞呈立方形、細胞間緊密接觸和堆積生長，觀察組細胞呈紡錘形、細胞伸長、細胞間接觸較松散。觀察組36、48 h時的OD值均較對照組降低(P均<0.05)。血清饑餓后再刺激36 h，觀察組處于G1期的細胞比例為71.75%，高于對照組的57.01%；觀察組處于S期的細胞比例為22.43%，低于對照組的35.88%(P均<0.01);48 h時兩組細胞周期比例比較差異無統計學意義。兩組MEK1、EGFR表達及EGFR第1016位和第1110位酪氨酸磷酸化水平比較差異無統計學意義，觀察組MEK1第217位和第298位絲氨酸磷酸化的水平降低(P均<0.01)。觀察組SPC2水平較對照組升高(P<0.01)。結論 A549細胞用DDW長期培養，可顯著抑制其細胞增殖和分化，其機制可能與降低MEK1的磷酸化水平、阻滯細胞周期G1/S期轉變以及誘導A549細胞由Ⅱ型肺泡上皮細胞向Ⅰ型肺泡上皮細胞轉化、提高細胞分化程度有關。

肺癌;低氘水；細胞周期；絲裂原活化的細胞外信號調節激酶；細胞分化

氘是氫的三種同位素之一[1]，自然存在的氘為正常細胞生長所必需[2，3]。氘的自然含量因在地球上的采樣位置不同而不同，其濃度范圍為120～160 ppm[4]。氫在地球上以水的形式存在最多，氘含量低于150 ppm的水稱為低氘水(DDW)。DDW可以在體外和體內抑制癌細胞生長[5，6]，已有報道將其用于肺癌腦轉移患者的輔助治療，使用DDW結合常規臨床治療可以延長腫瘤患者的生存期[7]。表皮生長因子受體(EGFR)和絲裂原活化的細胞外信號調節激酶(MEK)通路是影響腫瘤細胞增殖的重要信號通路，信號通路的激活與活性位點的磷酸化水平呈正相關[8]。2016年6～9月，我們使用DDW培養人肺腺癌A549細胞，觀察A549細胞EGFR和MEK1活性位點的磷酸化水平，并檢測肺泡Ⅰ型上皮細胞特異性蛋白標志物AQP5、T1a和肺泡Ⅱ型上皮細胞特異性蛋白標志物SPB、SPC1、SPC2、CFTR的表達變化，探討DDW對人肺腺癌A549細胞增殖和分化的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 A549細胞系購自中科院上海細胞庫，F12K培養基、胎牛血清和0.25%的胰酶-EDTA購自Thermo Fisher公司，碘化丙啶、BCA蛋白質濃度測定試劑盒和RIPA緩沖液購自碧云天生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自北京博爾邁生物技術有限公司，DDW(氘含量50 ppm)購自上海齊天生物科技有限公司，用于檢測MEK1、EGFR總蛋白的抗體、抗MEK1第217位絲氨酸磷酸化(MEK-pSer217)和第217位絲氨酸磷酸化(MEK1-pSer298)的抗體以及抗EGFR第1016位酪氨酸磷酸化(EGFR-pTyr1016)和第1110位酪氨酸磷酸化(EGFR-pTyr1110)的抗體購自美國Cell Signaling公司，抗AQ5、T1a、SPC1、SPC2和GADPH抗體購自美國Abcam公司，抗CFTR和SPB抗體購自美國Merk Millipore公司，耦聯有辣根過氧化物酶(HRP)的二抗購自美國KPL公司，化學發光試劑購自美國GE公司，其他化學試劑購自美國Sigma公司。

1.2 細胞分組與處理 將A549細胞分為對照組和觀察組，分別加入正常水配制的F12K培養基、DDW配制的F12K培養基中，加入終濃度為2 mmol/L的谷氨酰胺和10%胎牛血清。37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養30 d。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.3 細胞增殖觀察 將培養30 d的細胞加入0.25%的胰酶-EDTA消化，以1×105/mL接種于96孔培養板中。于12、24、36、48 h分別加入CCK-8試劑10 μL，繼續培養顯色90 min，用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度OD值。每個時間點設3個復孔，實驗共重復3次，取平均值。

1.4 細胞周期分析 將培養30 d的細胞加入0.25%的胰酶-EDTA消化，以1×105/mL接種到6孔培養板中。細胞貼壁后，對照組和觀察組細胞分別在不含血清的正常水培養基和DDW培養基中饑餓48 h使細胞生長同步化，然后加入含10%胎牛血清的正常水培養基和DDW培養基繼續培養36 h和48 h。加入胰酶消化，將細胞以2×105/mL重懸于碘化丙錠染色液中，避光染色30 min。用BD公司的FACS CaliburTM進行單個細胞內DNA含量的分析，細胞群體在細胞周期不同時相的分布用ModFit LT軟件進行擬合分析。

1.5 EGFR、MEK1蛋白表達及活性位點磷酸化檢測 采用Western blot方法。將培養30 d的細胞用含有蛋白酶抑制劑和磷酸脂酶抑制劑的預冷PBS洗滌，加入RIPA裂解液反復吹打裂解細胞，4 ℃離心收集上清液，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。每個泳道上蛋白質樣品50 μg進行SDS-PAGE后用濕轉法將蛋白條帶轉移到PVDF膜上。用含4%脫脂奶粉的PBST封閉，加入相應抗體(EGFR、MEK1抗體或針對活性位點磷酸化的抗體)4 ℃一抗孵育過夜，PBST洗滌3次后，用耦聯有HRP的二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，PBST洗滌，化學發光底物顯色，化學發光掃描儀記錄蛋白表達或蛋白活性位點磷酸化的條帶。以目標蛋白與內參蛋白GADPH灰度值的比值計算目標蛋白的相對表達量。

1.6 肺泡上皮細胞特異性蛋白標志物檢測 按照1.5中的方法提取兩組細胞的總蛋白，電泳并轉膜后進行Western blot分析，用抗AQ5、T1a、CFTR、SPB、SPC1、SPC2的抗體檢測各蛋白標志物的表達。以目標蛋白與內參蛋白GADPH灰度值的比值計算目標蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞形態比較 對照組細胞在倒置顯微鏡下呈立方形，細胞間接觸緊密和堆積性生長；觀察組細胞呈紡錘形，細胞伸長，細胞之間的接觸較對照組松散。

2.2 兩組細胞增殖情況比較 觀察組12、24、36、48 h的OD值分別為0.33±0.12、0.38±0.01、0.42±0.02、0.50±0.06；對照組分別為0.33±0.02、0.37±0.01、0.47±0.05、0.65±0.05。觀察組36、48 h時的OD值較對照組降低(P均<0.05)。

2.3 兩組細胞周期分布比較 觀察組36 h時處于G1期的細胞比例高于對照組，處于S期的細胞比例低于對照組(P均<0.01)。48 h時兩組細胞周期比例比較差異無統計學意義。見表1。

表1 兩組細胞周期分布比較

注：與對照組比較，*P<0.01。

2.4 兩組MEK1、EGFR磷酸化水平比較 觀察組MEK1蛋白表達與對照組比較無統計學差異;與對照組比較，觀察組第217位、第298位絲氨酸的磷酸化水平顯著下調。觀察組EGFR蛋白表達與對照組比較無統計學差異；第1016、第1110位酪氨酸的磷酸化水平也無明顯變化。

表2 兩組MEK1、EGFR及其活性位點的磷酸化水平

2.5 兩組肺泡上皮特異性標志物水平比較 DDW培養30 d后，觀察組AQP5、T1a、SPC1、SPC2水平較對照組升高，CFTR、SPB水平無明顯變化。提示觀察組部分A549細胞的分化類型由Ⅱ型上皮細胞向Ⅰ型上皮細胞轉化。見表3。

3 討論

表3 兩組肺泡上皮特異性標志物水平比較±s)

研究顯示，氘能夠影響細胞生長[8]。已有報道顯示，DDW能顯著延長前列腺癌和未轉移肺癌患者的生存期[5，9]。然而DDW對腫瘤細胞生長抑制的分子機制目前還不清楚。細胞周期是細胞分裂經歷的全過程，S期DNA進行復制，M期細胞進行分裂，S期和M期之前分別為G1生長期和G2生長期[10]。本研究顯示，DDW能夠抑制A549細胞從G1期向S期轉化，從而抑制其生長，這種生長抑制效應是由于DDW阻滯細胞周期由G1期向G2期轉變所致。

研究證明，A549細胞攜帶致癌基因KRAS/G12S激活突變，這一突變上調MAPK/ERK信號通路，從而促進A549細胞的分裂增殖[11，12]。為了探究DDW對A549細胞生長抑制作用的信號通路，我們選擇了與細胞有絲分裂密切相關的兩個重要分子EGFR和MEK1上與其活性有關的關鍵磷酸化位點上磷酸化水平變化進行研究。結果表明，DDW培養對EGFR的表達及其第1016及第1110位酪氨酸活性位點的磷酸化水平無明顯影響；對MEK1的表達水平雖無明顯影響，但可顯著降低其第217位和第298位絲氨酸的磷酸化水平。說明DDW可通過下調MEK/ERK信號通路抑制A549細胞增殖。

肺泡上皮根據形態和功能分為Ⅰ型上皮和Ⅱ型上皮，Ⅰ型上皮主要負責氣體交換，Ⅱ型上皮通過分泌表面活性蛋白來維持肺泡的表面張力[9]。A549細胞屬于Ⅱ型肺泡上皮細胞，能夠產生表面活性蛋白[9，13]。本研究發現，用DDW培養基培養A549細胞30 d后，細胞發生了顯著的形態學變化，由原來的立方形、細胞間接觸緊密和堆積性生長變為紡錘形、細胞伸長和細胞之間接觸較不緊密的生長。說明細胞的分化類型發生了變化。Western blot進一步檢測肺泡上皮細胞特異性蛋白標志物表達水平，發現DDW可顯著上調水通道蛋白AQP5和T1a兩種Ⅰ型肺泡上皮特異性蛋白標志物的表達，同時SPC1和SPC2兩種Ⅱ型上皮特異性蛋白標志物的表達也顯著提高。上述細胞形態學表型和特異性標志物水平的變化說明DDW可誘導A549細胞由Ⅱ型肺泡上皮細胞向Ⅰ型肺泡上皮細胞轉化，從而導致A549細胞的分化程度提高，惡性增殖能力下降。

綜上所述，DDW可通過下調MAPK/ERK信號通路，阻滯A549細胞細胞周期，抑制細胞增殖；DDW還可以誘導A549細胞由Ⅱ型肺泡上皮向Ⅰ型肺泡上皮的轉化。這些研究結果部分闡明了DDW抑制肺癌細胞增殖的分子機制，為DDW用于肺癌的輔助治療提供了依據。

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Effects of deuterium-depleted water on proliferation and differentiation of lung cancer A549 cells

QIBingxue,LIZiyi,CONGFengsong

(SchoolofLifeSciencesandBiotechnology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200240,China)

Objective To study the effects of deuterium-depleted water (DDW) on human lung cancer cell line A549 and to explore the underlying molecular mechanisms. Methods A549 cells were randomly divided into two groups: the observation group and the control group, which were seperately cultured in the medium prepared with 50 ppm DDW and in the medium prepared with normal water for 30 d. The morphology of cells was observed under an inverted microscope. Cell growth was measured using the colorimetric cell counting kit-8 (CCK-8) reagent to compare the growth rate of cells between the two groups. The cells in the two groups were synchronized by serum starvation and then were separately stimulated with medium containing 10% serum of DDW and medium containing normal water. At 36 and 48 h after the stimulation, cells from each group were trypsinized, stained with propidium iodide (PI) and then were analyzed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) to determine the percentages of cells distributed in G1, S and G2/M phases during cell cycle. Total proteins were extracted from cells cultured in normal medium or DDW medium. Western blotting was conducted to detect the expression levels of MEK1 and EGFR, phosphorylation of serine 217 and serine 298 on MEK1, and phosphorylation of tyrosine 1016 and tyrosine 1110. The expression levels of several alveolus-specific protein markers (type Ⅰ alveolus markers: AQP5 and T1a, type Ⅱ alveolus markers SPB, SPC1, SPC2 and CFTR) in cells of the two groups were also compared. Results In the control group, the cells were cuboidal and in close contact with accumulation of cells. In the observation group, the cells were spindle, and intercellular contact was loose with cell elongation. The OD of the observation group was lower than that of the control group (allP<0.05). After the serum starvation, cells were stimulated for 36 h, the percentage of cells in G1phase of the observation group was 71.75%, which was higher than that of the control group (57.01%), the percentage of cells in S phase was 22.43%, which was lower than that of the control group (35.88%), (allP<0.05). There was no significant difference in cell cycle ratio between the two groups at 48 h. No significant difference was found in the expression of MEK1, EGFR and the phosphorylation of EGFR on tyrosine 1016 and 1110 between these two groups. In the observation group, the phosphorylation of MEK1 on both serine 217 and serine 298 was significantly decreased (allP<0.01). The expression level of SPC2 in the observation group was significantly increased as compared with that of the control group (P<0.01).Conclusions Long-term cultivation of A549 lung cancer cells with DDW medium significantly inhibits the cell proliferation and differentiation, which is related to decreasing phosphorylation level of MEK1, arresting the G1/S phase transformation, inducing A549 cells from type Ⅱ alveolar epithelial cells to type I alveolar epithelial cells and improving the differentiation of A549 cells.

lung carcinoma; deuterium-depleted water; cell cycle; mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase; cell differentiation

國家自然科學基金資助項目(81272478)；教育部重點實驗室開放課題(AF4150013)。

戚冰雪(1988-)，碩士研究生，主要研究方向為低氘水對A549細胞的增殖抑制。E-mail: 647870061@qq.com

叢峰松(1970-)，副教授，主要研究方向為抗腫瘤藥物的研究與開發。E-mail: fsongcong@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.06.001

R734.2

A

1002-266X(2017)06-0001-04

2016-11-14)