解聚素金屬蛋白酶在自身免疫性關節炎中的表達及與疾病活動的相關性研究

毋靜++鄧家鑫++曲源++張玉萍++江珍蘭++于清宏

【摘 要】目的：探討解聚素金屬蛋白酶家族是否參與了自身免疫性關節炎的發病過程。方法：檢測自身免疫性關節炎患者外周血單個核細胞中解聚素金屬蛋白酶的表達，與疾病的炎癥活動指標及標志性抗體進行相關分析，關節炎類型包括類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡關節炎和其他結締組織病關節炎。結果：與健康對照者相比，解聚素金屬蛋白酶在類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡關節炎和其他結締組織病關節炎中均升高，疾病的活動性指標具有相關性。結論：解聚素金屬蛋白酶家族參與了自身免疫性關節炎的發病。

【關鍵詞】 關節炎，自身免疫性；解聚素金屬蛋白酶；ADAM8；ADAM15；ADAM19；疾病活動；相關性

On the Expression of Disintegrin Metalloproteinases in Autoimmune Arthritis and Its Correlation with Disease Activity

WU Jing，DENG Jia-xin，QU Yuan，ZHANG Yu-ping，JIANG Zhen-lan，YU Qing-hong

【ABSTRACT】Objective：To study the expression of disintegrin metalloproteinases in autoimmune arthritis and its correlation with disease activity.Methods：The expression of disintegrin metalloproteinases in peripheral blood mononuclear cells of patients with autoimmune arthritis was detected and its correlation with the inflammatory activity index and marked antibody was analyzed.The arthritis includes rheumatoid arthritis，systemic lupus erythematosus arthritis and other connective tissue disease arthritis.Results：Compared with the healthy controls，disintegrin metalloproteinases in the rheumatoid arthritis，systemic lupus erythematosus arthritis and other connective tissue diseases increased，which was associated with disease activity index.Conclusion：The family of disintegrin metalloproteinases involves in the pathogenesis of autoimmune arthritis.

【Keywords】 arthritis，autoimmune；disintegrin metalloproteinases；ADAM8；ADAM15；ADAM19；disease activity；correlation

自身免疫性關節炎為自身免疫性疾病的關節損害，癥狀包括關節疼痛、紅腫、僵硬及受影響關節功能障礙，典型的自身免疫性關節炎包括類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）、系統性紅斑狼瘡關節炎（systemic lupus erythematosus arthritis，SLEa）和結締組織病關節炎（connective tissue diseases arthritis，CTDa）。自身免疫性關節炎的發病機制仍然未完全清楚，但多項研究都表明基質金屬蛋白酶參與了自身免疫性關節炎的發病。因此探究金屬蛋白酶的新家庭成員——解聚素金屬蛋白酶（A disintegrin and metalloproteinase，ADAMs）是否參與該類疾病的發病機制具有重要意義。ADAM8可以被軟骨細胞合成，重組的ADAM8可以誘導軟骨代謝[1]。RA患者關節滑液中性粒細胞ADAM8的表達增高，而且滑液中性粒細胞ADAM8的表達和關節炎癥的程度具有相關性[2]，并且ADAM8也參與氣道高反應性過敏反應及哮

喘[3]。這些研究都提示，ADAM8通過炎癥反應通路參與多種炎癥性疾病。ADAM15則主要在血管形成中起重要作用，并且在退行性關節炎的基質重構中具有重要作用[4-6]。ADAM15在RA滑膜細胞中表達升高[7-9]。ADAM19在CD4+細胞中高表達，相關研究表明，ADAM19在炎癥性腸病和皰疹樣皮炎的病灶中表達升高[10-12]。目前，很少有ADAMs與關節炎，尤其是免疫性關節炎相關性的研究?；谘装Y性關節炎尤其是RA，滑膜增生與血管生成在疾病的早期起到重要作用，而ADAMs家族中多種成員參與血管形成。因此本研究針對ADAM8，15，19在關節炎尤其是免疫性關節炎中的表達及與疾病活動相關性為切入點進行

研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月至2015年12月在本院就診的門診或住院自身免疫性關節炎患者98例，其中RA患者50例，均符合美國風濕病學會（ACR）/歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）2009年

RA診斷標準；SLEa患者26例，均符合2009年系統性紅斑狼瘡國際協作組（SLICC）修改的ACR系統性紅斑狼瘡分類標準并且合并有關節炎癥狀；CTDa患者24例，均符合結締組織病診斷標準并且合并有關節炎癥狀。另選擇12名健康志愿者為健康對照組。

1.2 ADAM8、ADAM15、ADAM19 mRNA表達水平的檢測方法 收集自身免疫性關節炎患者及健康對照組基礎信息，包括臨床資料及紅細胞沉降率（ESR）、C-反應蛋白（CRP）、白細胞介素-6（IL-6）、類風濕因子（RF）及抗CCP抗體水平。采集自身免疫性關節炎患者及健康對照組外周血單個核細胞，采用ficoll梯度離心的方法分離各組外周血單個核細胞，將分離的研究者外周單個核細胞使用PBS清洗后加入1 mL Trizol試劑（Gibco公司），混勻，靜置5 min；加氯仿200 μL靜置

5 min，12 000 r·min-1離心機離心15 min；然后取上清加入500 μL異丙醇，靜置10 min，12 000 r·min-1離心機離心10 min，棄去上清；750 mL·L-1乙醇洗滌離心棄去上清，干燥沉淀5～10 min，溶解總RNA于DEPC水。使用反轉錄試劑盒（PrimeScript，TAKARA）進行cDNA反轉錄，將反轉錄用的引物，dNTP mixture和模板RNA混合，65 ℃，5 min，4 ℃；添加primrscript Buffer酶和RNase抑制劑，30 ℃，10 min，40 ℃，15～30 min，95 ℃，5 min，4 ℃。將取得的DNA模板1 μL，參考realtime-PCR試劑盒（TAKARA的SYBR Premis Ex Taq TM）說明書進行PCR擴增，反應條件：預變性95 ℃，20 s，變性95 ℃，5 s，退火60 ℃，25 s，延伸72 ℃，1 s，40個循環；終末延伸70 ℃，0.01 s得到PCR產物。引物見表1。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。組間差異采用單因素方差分析或非參數檢驗；相關性檢驗采用person相關性分析。以P ﹤ 0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基本資料 實驗對象分4組，RA組50例，男16例，女34例；年齡19～67歲，中位數44.1歲。SLEa組26例，男3例，女23例；年齡23～56歲，中位數41.5歲。CTDa組24例，均為女性；年齡21～60歲，中位數34.5歲。健康對照組12例，男3例，女9例；年齡28～40歲，中位數34.8歲。

2.2 ADAMs的表達 分析發現，ADAM8在自身免疫性關節炎中表達升高，見圖1（1）；ADAM8在RA組、SLEa組和CTDa組均增高，而健康對照組的表達則較低，健康對照組和各關節炎組間差異均有統計學意義（P = 0.002 8），而各關節炎組之間差異無統計學意義（P = 0.09）。提示ADAM8雖然參與了多種自身免疫性關節炎的炎癥過程，但并沒有特異性關節炎高表達。

RT-PCR檢測結果表明，與健康對照組相比，ADAM15在自身免疫性關節炎中增高（P = 0.004 1），

包括RA、SLEa以及CTDa，見圖1（2）。相較于RA組，ADAM15尤其在自身免疫性疾病的代表性疾病SLEa中高表達，組間差異有統計學意義

（P = 0.002 2），而RA組和CTDa組之間差異無統計學意義（P = 0.675 4）。

與健康對照組相比，ADAM19在自身免疫性關節炎中表達增高（P = 0.000 1），與ADAM15相似，ADAM19在SLEa中高表達，見圖1（3），組間差異有統計學意義（P = 0.007 1）。而RA組和CTDa組之間差異無統計學意義（P = 0.706 7）。

2.3 相關性分析 ADAMs和炎癥相關性分析結果顯示，ADAM8和CRP具有相關性，見圖2，r = 0.252，P = 0.008，說明ADAM8與炎癥反應具有相關性，這與ADAM8在所有關節炎中表達均升高結果一致，說明ADAM8的確參與了普遍的炎癥反應，所有關節炎類型中均表達增高；另外，ADAM8與RA的抗CCP抗體也具有相關性，見圖3，

r = 0.340，P = 0.004。ADAMs中的ADAM15和ADAM19

與自身免疫性關節炎的炎癥活動指標沒有明顯的相關性，與疾病的標志性抗體也沒有相關性。

3 討 論

自身免疫性關節炎是一組引起關節病變和功能障礙的疾病，癥狀包括關節疼痛、紅腫、僵硬及受影響關節功能障礙，典型的自身免疫性關節炎包括RA、SLEa和CTDa，自身免疫性關節炎的發展過程往往伴隨著炎癥過程，尤其是在疾病活動期，患者會表現出高的炎癥活動水平，ADAMs家族參與了多種炎癥疾病的發病過程；并且有證據證明ADAMs參與了自身免疫性炎癥的形成過程，提示其在自身免疫性疾病的發生中起重要作用，因此探究ADAMs與自身免疫性關節炎的相關性和深層機制對此類疾病的防治具有重大（下轉第21頁）

（上接第7頁）意義。本研究發現，ADAMs家族中ADAM8，15，19在自身免疫性關節炎患者外周血單個核細胞中的表達升高，提示其參與了自身免疫性關節炎的發病，尤其是ADAM8不僅參與了自身免疫性關節炎的發病過程，其和此類疾病的活動性指標具有相關性。ADAM15及ADAM19參與了多種自身免疫性關節炎的發病過程，在SLEa中的表達尤其升高。這提示ADAMs在自身免疫性關節炎中起到了重要作用，對ADAM8的調控可能起到控制關節炎發病的作用，尤其是炎癥期。而ADAM15及ADAM19主要參與了SLE的發病，針對這兩種ADAMs的調控可能起到控制SLE發病的作用。ADAM8，15，19在自身免疫性關節炎患者中高表達，使其成為研究自身免疫性關節炎的切入點之一，但還需要更多的研究支持，進一步探討ADAMs如何參與自身免疫性疾病的發病過程，將為自身免疫性疾病的治療帶來新的方向。

4 參考文獻

[1] Roodman GD.Regulation of osteoclast differentiation[J].

Ann N Y Acad Sci，2006，1068（1）：100-109.

[2] Knolle MD，Nakajima T，Hergrueter A，et al.Adam8 limits the development of allergic airway inflammation in mice[J].J Immunol，2013，190（12）：6434-6449.

[3] Chen J，Jiang X，Duan Y，et al.ADAM8 in asthma.Friend or foe to airway inflammation？[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2013，49（6）：875-884.

[4] Bohm BB，Aigner T，Gehrsitz A，et al.Up-regulation of MDC15（metargidin）messenger RNA in human osteoarthritic cartilage[J].Arthritis Rheum，1999，42（9）：1946-1950.

[5] B?hm BB，Aigner T，Roy B，et al.Homeostatic effects of the metalloproteinase disintegrin ADAM15 in degenerative cartilage remodeling[J].Arthritis Rheum，2005，52（4）：1100-1109.

[6] B?hm BB，Schirner A，Burkhardt H.ADAM15 modulates out-side-in signaling in chondrocyte-matrix interactions[J].

J Cell Mol Med，2009，13（8B）：2634-2644.

[7] Charrier-Hisamuddin L，Laboisse CL，Merlin D.ADAM-15：a metalloprotease that mediates inflammation[J].

FASEB J，2008，22（3）：641-653.

[8] B?hm BB，Aigner T，Blobel CP，et al.Highly enhanced expression of the disintegrin metalloproteinase MDC15 （metargidin）in rheumatoid synovial tissue[J].Arthritis Rheum，2001，44（9）：2046-2054.

[9] Komiya K，Enomoto H，Inoki I，et al.Expression of ADAM15 in rheumatoid synovium：up-regulation by vascular endothelial growth factor and possible implications for angiogenesis[J].Arthritis Res Ther，2005，7（6）：R1158-1173.

[10] Franzè E，Caruso R，Stolfi C，et al.High expression of the "A Disintegrin And Metalloprotease" 19（ADAM19），a sheddase for TNF-α in the mucosa of patients with inflammatory bowel diseases[J].Inflamm Bowel Dis，2013，19（3）：501-511.

[11] Dolcino M，Cozzani E，Riva S，et al.Gene expression profiling in dermatitis herpetiformis skin lesions[J].Clin Dev Immunol，2012，5：198956.

[12] Qi B，Newcomer RG，Sang QX.ADAM19/adamalysin 19 structure，function，and role as a putative target in tumors and inflammatory diseases[J].Curr Pharm Des，2009，15（20）：2336-2348.

收稿日期：2017-01-12；修回日期：2017-03-13