經圓窗膜導入ADNF-9基因防治卡那霉素耳毒性的實驗研究

景 陽,鄭國璽,祝 康,張璐瑤,劉 暉,張 文

1.陜西省人民醫院耳鼻咽喉科(西安710068),2.西安交通大學第二附屬醫院耳鼻咽喉科(西安710004)

經圓窗膜導入ADNF-9基因防治卡那霉素耳毒性的實驗研究

景 陽1,鄭國璽2△,祝 康2,張璐瑤2,劉 暉1,張 文1

1.陜西省人民醫院耳鼻咽喉科(西安710068),2.西安交通大學第二附屬醫院耳鼻咽喉科(西安710004)

目的：探討腺伴隨病毒(AAV)介導活性依賴性神經營養因子-9(ADNF-9)基因轉染對卡那霉素致豚鼠耳毒性的拮抗作用。方法：選用80只白色紅目豚鼠，聽功能正常，隨機分為四組,每組20只，A組(ADNF-9保護組)：左耳經圓窗注入ADNF-9后肌注卡那霉素；B組(空載體組)：左耳經圓窗注入AAV,后肌注卡那霉素；C組(人工淋巴液組)：左耳經圓窗注入人工淋巴液后肌注卡那霉素；D組(空白對照組)：僅肌注卡那霉素?？敲顾鼐洿笸葍葌茸⑸?00 mg/(kg·d)，共給藥6 d；停藥后6、14 d各組均行聽性腦干反應(ABR)檢測,停藥14 d后各組處死動物，行耳蝸石蠟病理切片及耳蝸基底膜鋪片觀察各組豚鼠耳蝸基底膜毛細胞形態學。結果：實驗前所有豚鼠的聽功能均正常；停藥后6、14 d的ABR閾值A組為(32.54±5.28)dB和(33.52±2.26)dB；B組為(77.56±4.18)dB和(78.00±5.48)dB；C組為(75.24±6.72)dB和(77.25±4.65)dB；D組為(78.00±3.32)dB和(78.25±3.26)dB。A組停藥后6、14 d與B組、C組及D組比較有統計學差異(P<0.05 )。耳蝸病理切片及基底膜鋪片均提示：A組耳蝸螺旋器細胞損害較輕，基底膜板基本完整；其余三組，耳蝸螺旋器毛細胞損害嚴重，基底膜有不同程度的損害。結論：ADNF-9基因轉染可以有效拮抗氨基糖苷類所致豚鼠耳毒性。

氨基糖苷類抗生素廣泛應用于臨床,但也因嚴重的不可逆的耳毒性限制了其應用。倪月秋等[1]發現，慶大霉素致聾豚鼠的部分耳蝸毛細胞具有一定的再生能力。沈嘯洪等[2]發現用中藥補腎聰耳片治療卡那霉素致聾豚鼠后，極少數耳蝸基底膜有所恢復,聽毛排列整齊,甚至可見絨纖毛,證實了聽毛細胞有恢復的跡象。本研究試圖從電生理學及行態學方面證實活性依賴性神經營養因子-9(ADNF-9)基因轉染可以有效拮抗氨基糖苷類所致豚鼠耳毒性。

材料與方法

1 材 料 耳廓反射正常的白色紅目豚鼠80只,體重250～350 g,雌雄不限,經測ABR反應閾值正常(西安交通大學實驗動物中心提供)；卡那霉素(天津藥業焦作有限公司提供)；ADNF-9、AAV和人工淋巴液(由西安華廣生物工程有限公司提供)。

2 實驗動物分組及處理 80只豚鼠隨機分為四組,每組20只。A組(ADNF-9保護組)：左耳經圓窗導入ADNF-9后肌注卡那霉素,共注射6 d；B組(空載體組)：左耳經圓窗注入載體腺伴隨病毒(AAV)后肌注卡那霉素,共注射6 d；C組(人工淋巴液組)：左耳經圓窗注入人工淋巴液后肌注卡那霉素,共注射6 d；D組(空白對照組)：僅肌注卡那霉素?？敲顾鼐?00 mg/(kg·d)大腿內側注射,停藥6、14 d進行聽力學檢測,每天根據動物實際重量調整卡那霉素用量。

3 經圓窗給藥方式 按30 mg/kg的戊巴比妥鈉(北京普博斯生物科技有限公司)腹腔注射麻醉A、B、C組豚鼠,麻醉滿意后,常規消毒鋪巾,選取左側耳背進路,充分暴露聽泡,在解剖顯微鏡下打開聽泡及暴露圓窗。A組用微量注射器將10 μl攜帶ADNF-9(包含1011個病毒顆粒)的溶液緩慢注入圓窗,縫合耳后切口,B組、C組以同樣的方法注入空載體及人工淋巴液10 μl,D組不做任何處理。

4 ABR測定 在用藥前、停藥后6 d及停藥后14 d進行ABR檢測。測試儀器為美國TDT公司的電生理測試儀。豚鼠按30 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔麻醉后,電極插入顱頂皮下作為記錄點擊,同側乳突皮下置入參考電極,對側乳突皮下置入接地電極,刺激率為21.1次/ms，帶通濾波100～3000 Hz,掃描時間12 ms，疊加512次,以波Ⅲ的最小刺激強度為反應閾值。

5 耳蝸病理切片制備與觀察 將每組取8只豚鼠斷頭,從枕骨大孔進剪,沿顱骨矢狀縫向前(鼻尖部)剪開顱骨,在小腦部位向左右外壓力,使顳骨和周圍組織分離,取出顳骨,打開聽泡迅速放入10%的中性福爾馬林中,解剖顯微鏡下挑開圓窗膜,挑除鐙骨,敞開前庭窗。在蝸尖部垂直于蝸軸進針,掀掉一小片骨殼。用玻璃吸管吸取固定液從蝸尖部將固定液擠壓注入耳蝸內,灌注5管即可。這樣,前庭階及鼓階就充滿了固定液,然后再固定24 h。將固定的顳骨周圍組織盡量修剪掉充分暴露耳蝸組織,將顳骨修成一塊與蝸軸方向一致的長方形,用10%的甲酸脫鈣48 h,流水沖洗4 h。脫水、浸臘,將標本蝸軸擺水平位進行包埋。沿蝸軸平行切面,連續切片,每片17 μm。采用HE游離切片染色的方法。切片經石炭酸,二甲苯透明后,攤平在載玻片上,加1滴加拿大樹膠封固,標號后放室溫下晾干,光學顯微鏡下鏡檢。

6 耳蝸毛細胞鋪片制備與觀察 取每組剩余豚鼠斷頭，解剖并完整取出聽泡,暴露耳蝸，挑開蝸尖、前庭窗，先后分別用5%的硝酸銀溶液、10%中性福爾馬林溶液從蝸尖至蝸底反復灌洗數次,日光暴曬，福爾馬林溶液固定，在解剖顯微鏡下行耳蝸基底膜鋪片,觀察耳蝸基底膜毛細胞的變化。

結 果

1 各組動物生長情況 實驗過程中,各組實驗動物都有不同程度的死亡,空白對照組死亡2只,ADNF-9保護組死亡3只,空載體組死亡3只,人工淋巴液組死亡1只。各組實驗動物體重都有不同程度的減輕,但差異無統計學意義(P>0.05)。

2 ABR閾值測定 各組動物給藥前后ABR具體反應閾值見表1。四組給藥前ABR閾值無統計學差異(P>0.05)。停藥后6、14 d ,B組、C組及D組ABR閾值比較無統計學差異(P>0.05)；停藥后6、14 d,A組的ABR閾值與B組、C組及D組比較有統計學差異(P<0.05 )。

表1 不同組各時間點的ABR閾值比較(dB)

注：與B組、C組、D組比較，*P<0.05

3 取材時中耳腔情況 取出聽泡后在顯微鏡下發現鼓室黏膜無增厚及充血，鼓室內無肉芽組織增生，無滲出液，圓窗膜無增厚等現象。

4 耳蝸HE染色情況 A組耳蝸螺旋器毛細胞損害較輕,基底膜板基本完整(圖1)。其余三組耳蝸螺旋器毛細胞損害嚴重,以外毛細胞為甚,內毛細胞損害較輕,基底膜板亦有不同程度損壞(圖2)。

5 耳蝸毛細胞鋪片情況 A組可見耳蝸基底膜基本完整，內毛細胞和外毛細胞整齊排列，可見點狀缺失(圖3A)。其余三組耳蝸基底膜可見不同程度的破壞，外毛細胞較內毛細胞損害重，可見片狀缺失(圖3B,圖3C,圖3D)。

圖1 A組石蠟病理切片(HE染色×100)

圖2 B組石蠟病理切片(HE染色×100)

圖3 耳蝸毛細胞鋪片(硝酸銀染色×100)

討 論

氨基糖苷類抗生素具有抗菌譜廣、性質穩定、殺菌力強及價格便宜等特點,一直作為抗革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的有效藥物應用于臨床。氨基糖苷類藥物中毒性聾成為耳聾的重要原因之一，尤其對兒童危害更大,更易造成兒童的永久性聽力喪失[3]。對氨基糖苷類抗生素耳毒性發病機制大多數學者認為主要是由于外毛細胞K+/Ca2+通道受氨基糖苷類抗生素的影響,引起神經系統的阻滯，進而使耳蝸毛細胞和聽神經得功能受到影響[4]。Schacht等[5]研究發現氨基糖苷類抗生素的急性中毒反應可能是阻斷了外毛細胞膜Ca2+通道和鈣電流抑制耳蝸微音器電位。氨基糖苷類抗生素慢性中毒所涉及的機制比較復雜,觀點主要集中在線粒體基因突變,自由基氧化損傷,經興奮性毒性和聽覺傳出神經系統等[6]。

神經營養因子是由靶組織分泌的一類特殊的蛋白質分子，在神經干細胞增殖、分化及存活的過程中必不可少,一方面可以為神經元提供營養,促進神經細胞的生長和發育，另一方面保護神經元，促進修復周圍神經[7]。而神經營養因子中有一類活性依賴性神經營養因子(ADNF)。研究者發現了ADNF-14上有一段9肽ADNF，比ADNF-14具有更強的營養和保護神經的功能，而且發揮作用的濃度更加多樣化[8]。有研究者發現用ADNF-9保護用河豚毒素(TTX)作用后的大腦皮層細胞，發現ADNF-9增減一個氨基酸引起ADNF-9作用水平的下降。Gordon等[9]研究發現用很低的一個濃度ADNF-9取拮抗在FeSO4作用的海馬細胞，發現海馬細胞死亡數減少，而且細胞內的線粒體功能得到提高，同時活性氧的聚集減少，從而減輕了海馬細胞損傷。有研究發現ADNF-9為神經元提供營養，促進神經元突觸早期的形成[10]。ADNF-9分子量較小,可以通過血腦屏障,從而發揮功能。本課題前期研究發現ADNF-9可以通過血迷路屏障,成功轉染新生大鼠耳蝸,使其在內耳表達和發揮作用[11-12]。

基因治療是通過某種手段外源基因導入生物體的靶細胞內,使其在靶細胞內進行表達,來達到彌補生物體所缺失的功能或抑制某些基因的表達。有研究發現Atoh1基因可以成功轉染到哺乳動物耳蝸，促進Corti器功能恢復。也有研究者發現氨基糖苷類中毒所致豚鼠耳蝸也可以被Atoh1基因所轉染,而且使耳蝸毛細胞再生[13]。所以內耳的基因治療是可行的。如何選擇一種方便、合適的載體成為了重中之重。應用于內耳基因治療的載體大致可分為兩大類：非病毒載體和病毒載體。各種不同的載體有其不同的特點。有研究發現NGB基因可以在耳蝸表達,有效拮抗氨基糖苷類抗生素的耳毒性[14]。本研究所使用的AAV 載體較其他載體有其獨特的特點,如轉染率較高,轉染的細胞范圍較廣,不攜帶病原性等[15]。本研究將腺伴隨病毒介導ADNF-9基因導入氨基糖苷類藥物中毒的豚鼠耳蝸內,結果表明,ADNF-9保護組的實驗動物的聽功能和耳蝸毛細胞受損程度較人工淋巴液組、空載體組及空白對照組明顯小。從而證實了ADNF-9對耳蝸組織的形態和功能的恢復起到了一定的作用。但對于ADNF-9基因轉染拮抗氨基糖苷類耳毒性的具體機制還有待于進一步的研究。

[1] 倪月秋.中藥對氨基糖苷類抗生素致聾耳蝸毛細胞再生修復影響的研究進展[J].沈陽醫學院學報,2010,12(4)：193-196.

[2] 沈嘯洪,林文森.補腎聰耳片對卡那霉素致聾豚鼠聽毛細胞修復研究[J].天津醫藥,2004,32(1)：38-39.

[3] 伍 越,鄭 靜,鄭斌嬌,等.氨基糖苷類抗生素耳毒性的保護和修飾[J].中華兒科學雜志,2012,10(2):260-269.

[4] Takumida M,Takumida H,Anniko M.Localization of sirtuins in the mouse inner ear[J].Acta Otolaryngol,2014,134(4):331-338.

[5] Schacht J.Altschuler R,Burke DT,etal.Alleles that modulate late life hearing in genetically heterogeneous mice[J].Neurobiol Aging,2012,33(8)：1842.

[6] Campbell KC,Martin SM,Meech RP,etal.D-methionine(D-met)significantly reduces kanamycin-induced ototoxicity in pigmented guiea pigs[J].IntJ Audiol,2016,55(5)：273-278.

[7] Shakhbazau A,Martinez JA,Xu QG,etal.Evidence for a systemic regulation of neurotrophin synthesis in response to peripheral nerve injury[J].J Neurochem,2012,122：501-511.

[8] Sari Y.Experimental methods for testing the effect of neurotrophic Peptide ADNF-9 against alcohol-induced apoptosis during pregnancy inC57bl/6 mice[J].J Vis Exp,2013,24(74)：5009-5012.

[9] Gordon T.The physiology of neural injury and regeneration:the role of neurotrophic factors[J].J Commun Disord,2010,43:265-273.

[10] Katsari E,Zikos C,Tziveleka LA,etal.Cholesteryl-functionalized ADNF-9 peptide:enhanced membrane transport through mouse neuroblastoma Neuro-2a cells[J].Chem Biol Drug Des,2012,80(1)：148-154.

[11] 鄭國璽,祝 康,韋俊榮，等.重組腺相關病毒rAAV-NT4-ADNF-9轉染大鼠耳蝸組織的體外研究[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2009,23(4)：170-173.

[12] 景 陽,鄭國璽,祝 康,等.腺伴隨病毒介導ADNF-9基因轉染對豚鼠卡那霉素致聾的治療作用[J].江蘇大學學報：醫學版,2015,25(5)：369-372.

[13] Stojanova ZP,Kwan T,Segil N.Epigenetic regulation of Atoh1 guides hair cell development in the mammalian cochlea[J].Development,2015,142(20)：3529-3536.

[14] 任 毅,周 琦,唐安洲,等.NGB基因轉染拮抗慶大霉素耳毒性作用的實驗研究[J].聽力學及言語疾病雜志,2012,20(4)：349-353.

[15] Fuchs SP,Martinez-Navio JM,Gao G,etal.Recombinant AAV Vectors for Enhanced of Authentic IgG[J].PLos One,2016,11(4)：158-159.

(收稿：2016-07-14)

*高等學校博士學科專項科研基金項目(20120201110060)

卡那霉素 毛細胞,耳 圓窗,耳 基因 轉染 @活性依賴性神經營養因子-9

R764.4

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.002

△通訊作者