RNA干擾抑制KLF10基因對MG-63細胞成骨分化的影響

付峰勃,殷 霄

西安市中心醫院口腔科(西安 710003)

△通訊作者

RNA干擾抑制KLF10基因對MG-63細胞成骨分化的影響

付峰勃,殷 霄△

西安市中心醫院口腔科(西安 710003)

目的：研究Kruppel樣因子10(KLF10)在MG-63細胞向成骨細胞分化過程中的作用。方法：采用RNA干擾的方法抑制MG-63細胞中KLF10的表達，并使用成骨分化培養液誘導細胞分化，實時定量PCR檢測成骨分化標志性基因ALP、OC、BSP 及轉錄因子Runx2的mRNA的表達量變化，蛋白質印跡檢測Runx2的蛋白表達。結果：誘導分化后，KLF10表達抑制細胞的ALP、OC的mRNA表達量低于正常細胞(P<0.05)；KLF10表達抑制會直接導致Runx2的mRNA及蛋白表達量降低。結論：KLF10在MG-63細胞成骨分化過程中發揮重要作用。

骨組織的重建與損傷修復是正畸和種植治療的基礎。在此過程中，機體依靠成骨細胞與破骨細胞的分化調節著骨組織的動態平衡。當間充質細胞誘導分化為成骨細胞后，開始持續分泌細胞外基質并礦化形成新的骨組織，以達到骨修復與改建的效果。成骨細胞的分化受到多種轉錄因子及信號通路調節，其中TGF-β信號通路是研究最多也是最明確的調節成骨細胞分化的信號之一[1]，其眾多下游信號分子也被證實參與了成骨細胞分化調節。Kruppel樣因子10(Kruppel-like factor 10，KLF10)是Kruppel樣家族轉錄因中的一員。它編碼的480-氨基酸蛋白在NH2末端區域有若干Src同源結構域，并在COOH末端區域有3個C2H2類鋅指結構DNA結合序列。KLF10最早是Subramaniam等在人成骨細胞中發現的，此研究發現TGF-β處理人成骨細胞后可以通過PCR檢測到KLF10的表達[2]。之后的研究表明KLF10在很多細胞核中都有表達，TGF-β直接調控其表達。通過對KLF10基因敲除的小鼠研究發現，小鼠呈現性別特異性的骨質疏松：母鼠出現骨密度及礦化成分減少，骨強度喪失。進一步細胞層面的研究發現，KLF10敲除導致母鼠成骨細胞數量減少、顯微結構改變。體外細胞研究也顯示KLF10能夠調節與成骨分化密切相關的轉錄因子Runx2的表達與活性[3]。因此，以上眾多的研究都表明，KLF10與成骨細胞的分化有密切關系。然而關于KLF10在成骨細胞分化中作用的體外研究并不透徹，KLF10是否參與了MG-63細胞的成骨向分化，目前仍沒有確切的研究結論。本實驗采用RNA干擾的方式，抑制MG-63細胞中KLF10的表達，觀察KLF10缺失條件下MG-63在受到成骨分化誘導時特性的改變，以探討KLF10對MG-63細胞分化命運的調控，為骨組織損傷修復與重建提供新的研究思路。

材料與方法

1 材 料 MG-63細胞系(購于ATCC，美國)；α-MEM培養基、胎牛血清(Gibco BRL，美國)；L-抗壞血酸、β-磷酸甘油、細胞培養用地塞米松(Sigma-Aldrich，美國)；Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑、Trizol(Invitrogen，美國)；RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit反轉錄試劑盒(Thermo，美國)；SYBR Premix EX Taq(Takara，日本)；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(凱基生物科技發展有限公司，南京)；Anti-KLF10 抗體、Anti-β-actin抗體(Abcam，英國)；Anti-Runx2抗體(Santa Cruz，美國)；PVDF膜(Roche，瑞士)；二氧化碳恒溫孵箱(Thermo，美國)；熒光定量PCR儀、酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad，美國)；Image Quant 350 快速化學光成像系統(GE，美國)。

2 實驗方法 ①轉染抑制KLF10的shRNA表達載體：MG-63細胞系培養采用含10%胎牛血清的α-MEM培養液，培養于飽和濕度37 ℃、5% CO2細胞培養箱中。根據文獻[4]中已驗證的針對KLF10基因的siRNA干擾序列(5’-GAA CCC TCT CAA GTG TCA AAT-3’)，經過BLAST驗證確定干擾靶點唯一后交由上海吉瑪技術有限公司利用pGPH1/GFP/Neo載體構建相應的shRNA表達質粒。取生長狀態良好的MG-63細胞均勻接種至6孔細胞培養板中，待細胞生長至80%融合后使用Lipofectamine 2000將shRNA表達質粒轉染至細胞內，命名為si-KLF10常規培養24 h后提取細胞RNA及蛋白進行后續實驗。②KLF10 mRNA的檢測：取轉染shRNA及正常的MG-63細胞，棄培養液后PBS清洗，加入Trizol提取細胞總RNA，定量后取1 μg RNA，使用RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit試劑盒反轉錄為cDNA，保存于-80℃冰箱備用。設計KLF10及GAPDH引物，序列如下。KLF10：正向5’- ACT GCC AAA CCT CAC ATT GC -3’, 反向 5’-ACG AAT CAC ACT TGT TGC CTG-3’。GAPDH：正向5’-GAC CCC TTC ATT GAC CTC A-3’ 反向5’-GCT CCT GGA AGA TGG TGA-3’。 PCR反應體系如下：SYBR Premix EX Taq 12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 8.5 μl。實時定量反應條件如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延展10 s，讀取熒光，45個循環；65～95 ℃每次遞增0.5℃加熱5 s并讀取熒光繪制溶解曲線以驗證擴增的特異性，后冷卻至4 ℃。將GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt法計算KLF10 mRNA的相對表達量。實驗重復3次，統計分析各組細胞間差異。③蛋白質印跡(Western blot)檢測KLF10的蛋白表達：取轉染shRNA及正常的MG-63細胞，棄培養液并用預冷PBS清洗后，胰蛋白酶消化收集細胞，按照試劑盒說明步驟提取細胞蛋白。BCA法測定各組蛋白濃度后按比例加入5×Loading Buffer，開水煮沸5 min。取等量蛋白樣本進行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)，根據KLF10蛋白及β-actin蛋白分子量大小截取凝膠并轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h。分別用Anti-KLF10 抗體，Anti-β-actin抗體室溫孵育1 h，4 ℃過夜，TBST洗膜，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后加化學發光試劑浸潤，ImageQuant 350成像。④成骨分化誘導：實驗分為兩組，對照組為正常MG-36細胞，實驗組為轉染shRNA表達載體的KLF10表達抑制的MG-63細胞。成骨分化誘導前取生長良好的MG-63細胞接種至6孔培養板，實驗組按上述方案轉染后培養24 h，對照組常規培養。之后兩組均更換為含有50 ng/ml L-抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉及1×10-8mmol/L地塞米松并添加10%胎牛血清的α-MEM培養液誘導分化。培養72 h后收集細胞提取RNA，實時定量PCR檢測成骨標志性基因堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣蛋白(OC)、骨唾液酸蛋白(BSP)以及成骨調節轉錄因子Runx2的mRNA表達量，引物序列如下。ALP：5’- ACT GGT ACT CAG ACA ACG AGA T -3’, 反向 5’- ACG TCA ATG TCC CTG ATG TTA TG -3’。OC：5’- CAC TCC TCG CCC TAT TGG C -3’, 反向 5’- CCC TCC TGC TTG GAC ACA AAG-3’。BSP：5’- CAC TGG AGC CAA TGC AGA AGA -3’, 反向 5’- TGG TGG GGT TGT AGG TTC AAA -3’。Runx2：正向5’- TGG TTA CTG TCA TGG CGG GTA -3’, 反向 5’- TCT CAG ATC GTT GAA CCT TGC TA-3’。同時提取細胞蛋白Western blot檢測Runx2蛋白表達。

結 果

1 KLF10干擾效率的驗證 將干擾KLF10的shRNA表達質粒轉染入MG-63細胞系后，由于載體帶有GFP綠色熒光蛋白，可見絕大多數細胞均成功轉染，呈現綠色熒光(圖1 A)，說明本實驗達到較高的轉染效率。之后，我們檢測了轉染后細胞KLF10 mRNA的相對表達量，結果顯示經過shRNA干擾后細胞的KLF10 mRNA表達水平降低到之前的40%左右(圖1 B)。進一步Western blot同樣驗證了siRNA干擾后的MG-63細胞KLF10蛋白表達顯著降低(圖1C)。

A：shRNA表達質粒轉染效率；B：實時定量PCR檢測KLF10 mRNA相對表達量；C：Western blot檢測KLF10蛋白

2 KLF10表達抑制對MG-63細胞成骨分化誘導后成骨標志性基因mRNA表達的影響 MG-63細胞經過siRNA干擾KLF10后ALP mRNA表達并無明顯變化(P>0.05)(圖2 A)。經過成骨誘導分化72 h后，正常MG-63細胞及KLF10抑制的si-KLF10細胞的ALP mRNA水平都顯著提升(P<0.05)，分別提升了6倍及4倍左右；同時，無論是否經過成骨分化誘導，KLF10抑制卻可導致MG-63細胞中OC mRNA表達量的持續降低(圖2B)。然而，無論是否經過成骨分化誘導，KLF10抑制都對MG-63細胞中BSP mRNA表達量無顯著影響(圖2 C)。

3 KLF10表達抑制對MG-63細胞中成骨調節轉錄因子Runx2的影響 成骨分化誘導能夠顯著提升Runx2的表達。然而siRNA干擾KLF10表達下降后，無論是否進行成骨分化誘導，MG-63細胞中的Runx2 mRNA及蛋白的表達量都要顯著低于正常MG-63細胞(圖3)。

相同*標識的兩組之間存在統計學差異(P<0.05)；相同#標識的兩組之間不存在統計學差異(P>0.05)

圖3 各組細胞中Runx2 mRNA (A)及蛋白(B)的表達

討 論

MG-63細胞系是骨肉瘤細胞來源的永生化細胞系，經過成骨分化誘導液及多種因子如TGF-β、BMP2等誘導后可表現出成骨細胞的特性并形成礦化結節，因此眾多實驗都將選用它進行成骨分化調控的研究[5-7]。TGF-β對成骨細胞分化的調控較為復雜，不僅通過其下游的smads分子發揮作用，還與notch、Wnt等多種信號通路均有交通與對話。KLF作為其直接的效應分子，也與成骨發育密切相關。從KLF10基因敲除小鼠顱蓋中分離的成骨細胞在體外培養時呈現分化延遲及基質分泌、礦化障礙[3]，說明KLF10在成骨細胞分化過程中起到不可或缺的作用。另一方面，KLF10還在肝癌、乳腺癌、胰腺癌等眾多惡性腫瘤細胞增殖、凋亡的調控機制中發揮重要作用[4,8]。那么KLF10在腫瘤細胞來源的MG-63細胞系中是依舊行使其成骨活性，還是促使細胞向腫瘤增殖方向發展呢？本實驗在體外采用RNA干擾的方法抑制MG-63細胞中KLF10的表達，以觀察其成骨特性的改變。

ALP在組織礦化過程中發揮非常重要的作用，常在成骨細胞分化早期表達。而OC則是成骨細胞分化的晚期標志物[7]。本實驗結果表明KLF10抑制的細胞經過分化誘導后ALP，OC表達的增加量低于正常細胞。這表明KLF10對ALP、OC的表達都有著調控作用。而在分化誘導之前KLF10被抑制并沒有直接導致MG-63細胞中ALP mRNA表達量的減少，這可能是由于未分化的MG-63細胞中ALP的表達量很低造成的。BSP是也一種和成骨密切相關的的胞外糖蛋白，本實驗中發現雖然成骨分化誘導能夠顯著提高BSP的表達，但KLF10表達抑制對BSP的表達無顯著影響。有研究表明BSP不僅在礦化相關細胞中表達，在腫瘤細胞中也有明確表達并發揮重要作用[9]，因此，在MG-63細胞系中，BSP可能到其他信號通路的調節。

Runx2是成骨細胞分化調控的一個關鍵性轉錄因子，同時，它也被證實是受TGF-β調控的下游分子。本實驗表明在MG-63細胞系中，KLF10對Runx2有直接的調控作用，這與Hawse等[3]在KLF10基因敲除的狗顱蓋骨成骨細胞的研究結果相一致。由于Runx2作為轉錄因子直接調控眾多成骨相關因子的表達[10]，因此KLF10在MG-63細胞系中的調控作用可能是通過Runx2實現的，但其中的確切機制仍需進一步研究。

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(收稿：2016-12-21)

RNA干擾 成骨細胞 細胞分化 類Kruppel轉錄因子 @MG-63細胞系

R783.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.006