心肌聲學造影評價胰島素不同干預時間點對糖尿病大鼠心肌灌注的影響

張 展

張 軍2ZHANG Jun

劉 芳1LIU Fang

拓勝軍2TA Shengjun

岳瑾琢1YUE Jinzhuo

賀建國2HE Jianguo

心肌聲學造影評價胰島素不同干預時間點對糖尿病大鼠心肌灌注的影響

張 展1ZHANG Zhan

張 軍2ZHANG Jun

劉 芳1LIU Fang

拓勝軍2TA Shengjun

岳瑾琢1YUE Jinzhuo

賀建國2HE Jianguo

中國醫學影像學雜志

2017年 第25卷 第6期：405-408，413

Chinese Journal of Medical Imaging 2017 Volume 25 (6): 405-408, 413

目的應用心肌聲學造影（MCE）技術評價胰島素不同時間點干預糖尿病大鼠心肌微循環灌注的差異，探討MCE在糖尿病心肌?。―CM）療效評價中的價值。材料與方法將90只SD大鼠按隨機數字表法分為對照組（NC）、糖尿病組（DM）和胰島素干預組（INS），每組30只。成功制備糖尿病模型后，INS組隨機分A、B、C 3個亞組，分別于成模0、4、8周后開始胰島素干預，均連續給藥12周；NC和DM組也隨機分為3個亞組，與INS組各亞組同步飼養，不予干預。于成模后12、16、20周末對各亞組大鼠開胸行MCE檢查，分析心肌血容量（A）、血流速度（β）和血流量（A×β）的變化，并取心肌組織行病理學檢查。結果與DM組比較，INS組A、β和A×β均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與NC組比較，INS組A亞組A×β減低，B亞組A、A×β減低，C亞組A、β、A×β均減低，差異有統計學意義（P＜0.05）；INS組各亞組間比較，A、B亞組間各指標差異無統計學意義（P＞0.05）；C亞組A、A×β低于A亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）。病理結果顯示，INS組毛細血管基底膜厚度較DM組改善；毛細血管密度INS各亞組均較DM組增加，僅A亞組差異有統計學意義（P＜0.05）。結論胰島素早期干預可改善心肌微血管結構，增加心肌血流量。MCE可敏感、準確地對DCM大鼠的心肌微循環進行評價，可作為DCM早期診斷和動態療效監測的重要方法，具有重要的臨床指導意義。

糖尿病并發癥；心肌疾??；胰島素；超聲心動描記術；造影劑；心肌再灌注；微循環；疾病模型，動物；大鼠，Sprague-Dawley

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者存在病程及病情不一，治療時間、方法及依從性不一等客觀條件限制，且難以在各個治療階段獲取心肌組織進行組織和細胞水平檢測驗證，無法對糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）療效進行客觀評價。本實驗選取成熟的DM大鼠模型，使用心肌保護作用確定的胰島素在不同時間點進行療程相同的干預[1-4]；并應用心肌聲學造影（myocardial contrast echocardio-graphy，MCE）技術對心肌微循環灌注改變作出定量評價，以電鏡和免疫組化結果作為印證，為DCM的療效評估提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 SD雄性大鼠90只，體重220～300 g，平均（260.1±24.3）g，由第四軍醫大學動物中心提供[SCXK（軍）2012-0007]。按隨機數字表法分為對照組（NC）、糖尿病組（DM）和胰島素干預組（INS），每組30只。單次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液65 mg/kg制作DM模型，第5、7天采尾靜脈血，血糖濃度＞16.7 mmol/L，且具有明顯“三多一少”癥狀為模型制備成功，NC組注射等量緩沖液。模型建成后，INS組再隨機分A、B、C 3個亞組，分別在成模0、4、8周后開始皮下注射精蛋白生物合成人胰島素（諾和靈?N）6 U/kg，1次/d，均連續給藥12周。NC、DM組也隨機分為A、B、C 3個亞組，并與INS各亞組同步飼養，不給予干預。A、B、C亞組大鼠分別在成模12、16、20周末檢測各項指標。

1.2 儀器與方法 使用Acuson Sequoia 512超聲診斷儀，15L8-S線陣探頭，頻率8～14 MHz。 麻醉大鼠，頸靜脈插管、接呼吸機和心電圖。開胸取左心室乳頭肌短軸切面，MCE二維-造影雙幅模式，經優化后增益設置在實驗中保持不變。以0.9 ml/（kg·min）連續輸注SonoVue造影劑（Bracco公司），當充盈穩定后觸發瞬時高能脈沖破壞心肌內微泡，獲得再灌注實時成像，存儲250幀[3]。應用Syngo?US Workplace軟件脫機分析，勾畫心肌內感興趣區，得到聲學強度-時間曲線y=A×（1－e－βt）。A代表心肌血容量；β代表血流速度；A×β值代表心肌血流量（圖1）。分析3次取平均值，擬合度＜0.9棄用。

圖1 大鼠MCE圖像分析。A. MCE二維-造影雙幅模式；B. Syngo US Workplace分析界面；C. 聲學強度-時間曲線

1.3 病理檢查 實驗結束處死動物后，左心室心肌固定部位取材，10%甲醛固定，石蠟包埋切片行CD31免疫組化染色。隨機選取10個（×400）高倍鏡視野計數，取平均值作為毛細血管密度；另取4塊1 mm×1 mm×4 mm組織，多聚甲醛-戊二醛固定，透射電鏡觀察毛細血管超微結構。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件，計量資料以±s表示，檢驗正態分布和方差齊性后，各組間參數比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 實驗中2只造模失敗剔除（空腹血糖未升高），DM組B亞組死亡2只、C亞組死亡3只。余均無死亡。

2.2 一般指標比較 與NC組比較，INS組、DM組各亞組血糖增高，體重減低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與DM組比較，INS組各亞組血糖減低，體重增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；INS組各亞組間比較，血糖、體重差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 大鼠MCE指標比較 與NC組比較，DM各亞組A、β和A×β均減低，差異有統計學意義（P＜0.05）；INS組A亞組A×β減低，B亞組A、A×β減低，C亞組各指標均減低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與DM組比較，INS組各亞組A、β和A×β均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。INS各亞組間比較，A、B亞組間各指標差異無統計學意義（P＞0.05）；C亞組A、A×β低于A亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。2.4 大鼠毛細血管密度比較 與NC組比較，DM組、INS組毛細血管密度均減低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與DM組比較，INS組A亞組增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；B、C亞組亦有增加，差異無統計學意義（P＞0.05）。INS各亞組間比較，B、C亞組均低于A亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1 各組大鼠一般指標比較（±s）

表1 各組大鼠一般指標比較（±s）

分組 血糖（mmol/L） 體重（g）NC組A亞組（n=10） 6.48±0.79 580.62±46.54 B亞組（n=10） 6.01±0.58 606.15±40.62 C亞組（n=10） 5.66±0.46 628.96±41.25 DM組A亞組（n=9） 31.03±4.24* 382.13±34.22*B亞組（n=7） 32.35±1.49* 332.56±38.44*C亞組（n=7） 31.75±2.15* 301.25±33.64*INS組A亞組（n=10） 17.11±5.62*# 495.65±37.75*#B亞組（n=10） 19.18±2.68*# 521.28±48.53*#C亞組（n=10） 20.45±4.46*# 533.52±45.54*#注：與NC組比較，*P＜0.05；與DM組比較，#P＜0.05

表2 各組大鼠MCE指標比較（±s）

表2 各組大鼠MCE指標比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與DM組比較，#P＜0.05；與INS組A亞組比較，△P＜0.05

分組 A（dB） β（/s） A×β（dB/s）NC組A亞組（n=10）21.17±1.95 1.07±0.14 23.37±2.13 B 亞組（n=10）21.06±2.14 1.06±0.13 23.25±2.27 C 亞組（n=10）22.25±2.10 1.07±0.15 25.42±2.10 DM組A亞組（n=9）14.32±1.53* 0.94±0.09* 12.53±1.55*B亞組（n=7）12.16±1.27* 0.90±0.10* 11.61±1.34*C亞組（n=7）10.25±1.76* 0.78±0.14* 9.15±1.45*INS組A亞組（n=10）19.67±1.68# 1.04±0.15# 20.90±2.52*#B 亞組（n=10）19.16±1.48*# 1.03±0.12# 19.69±1.48*#C 亞組（n=10）16.65±1.94*#△ 1.01±0.17*#17.94±2.18*#△

表3 各組大鼠毛細血管密度比較（±s）

表3 各組大鼠毛細血管密度比較（±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05；與DM組比較，#P＜0.05；與INS組A亞組比較，△P＜0.05

分組 毛細血管密度（個/mm2）NC組A亞組（n=10） 2130.0±260.2 B亞組（n=10） 2259.6±244.0 C亞組（n=10） 2127.6±198.1 DM組A亞組（n=9） 1246.0±155.5*B亞組（n=7） 1114.3±284.7*C亞組（n=7） 991.1±89.0*INS組A亞組（n=10） 1465.6±214.3*#B 亞組（n=10） 1118.5±140.4*△C 亞組（n=10） 1097.2±126.6*△

2.5 大鼠毛細血管超微結構比較 透射電鏡下NC組毛細血管基底膜薄而光滑，內皮無腫脹；DM組血管基底膜明顯增厚，C亞組為著；INS組A、B亞組基底膜不厚，內皮細胞局部指狀突向腔內，C亞組基底膜較DM組明顯改善，較NC組稍厚，內皮細胞多發突向管腔。見圖2。

3 討論

DCM是在DM心肌代謝紊亂和微血管病變的基礎上出現心肌細胞廣泛灶性壞死，進而導致心臟結構和功能發生改變的疾病狀態[5]。微血管病變在DCM的發生及發展中起重要作用[6-7]；由此提示針對微血管病變的檢測和療效評價可作為DCM診療新思路。常規超聲僅能反映心肌力學改變，無法評價微循環灌注，心肌核素掃描、心臟MRI可用于評價心肌微循環，但無法動態觀察和對心肌血流量做定量分析[8]。因此，探尋一種敏感、準確的心肌灌注評價方法以指導DCM早期干預和療效評價具有重要的臨床意義。

MCE是一種無創的檢測心肌血流灌注新技術。通過 fl ash閃爍成像破壞心肌內的超聲微泡觀察造影劑的再灌注成像，MCE可以對心肌微循環灌注進行定量評價[9]。在檢測冠狀動脈疾病心肌灌注方面，MCE和單光子發射計算機斷層掃描結果顯著相關，且MCE敏感性更高[10]。相關研究發現DM大鼠心肌血流量較對照組明顯減低，并通過核素掃描及病理結果驗證，證明MCE檢測的心肌血流量可準確評估體內狀態的心肌灌注情況[11-12]。

本研究結果表明，與DM組相比，INS各亞組A、β、A×β均顯著增高（P＜0.05），提示胰島素治療能增加DM大鼠的心肌微循環灌注，延緩DCM病變進展，其原因為胰島素早期治療能在一定程度上逆轉毛細血管和內皮細胞的結構損傷，進而改善血管內皮功能，增加心肌血容量和血流量，這與von Bibra 等[13]的結果相似。這一結果也通過透射電鏡得到驗證：INS組毛細血管基底膜厚度較DM組減小，管腔有效面積增大，與Thompson[14]的基礎實驗結論相符。這表明MCE指標可以準確、客觀地反映治療后心肌灌注較病變組的改善程度。與NC組比較，INS組各亞組MCE評價指標偏低（P＜0.0.5），這表明即使成模后即刻進行胰島素治療，亦無法完全恢復正常的心肌灌注，推測可能與實驗中血糖偏高有關。高血糖可以破壞血管生成相關因子的平衡，降低促血管生成素-1及其受體的表達，導致毛細血管生成減少[15]。另外，長期慢性高血糖作用也會使心肌超微結構出現不可逆性的損害。本研究中免疫組化結果顯示，INS組毛細血管計數僅A亞組較DM組稍有改善（P＜0.0.5），B亞組、C亞組與DM組間差異無統計學意義（P＞0.0.5）。毛細血管密度減低可通過A和A×β反映，因此MCE指標亦能敏感地反映治療后心肌灌注與對照組的差異。INS不同亞組間比較，C亞組A、A×β低于A亞組（P＜0.0.5），B亞組各指標與A亞組差異無統計學意義（P＞0.0.5），病理學結果與之相印證：A亞組與B亞組毛細血管超微結構基本正常，而C亞組基底膜稍厚，血管內皮細胞突向管腔，導致血管有效面積縮小。MCE能敏感地檢出INS組與DM組、INS組與NC組以及INS組亞組間心肌微血管灌注的差異，其中A、A×β可作為MCE療效監測的重要參數。

圖2 大鼠心肌毛細血管超微結構（醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，×12 000）。A. NC組C亞組毛細血管基底膜薄而光滑；B. DM組C亞組毛細血管基底膜明顯增厚（箭頭）；C. INS組C亞組毛細血管基底膜稍厚，血管內皮細胞突向管腔內（箭）

本研究將所有大鼠在開胸狀態下進行檢查，均獲得良好的聲像圖質量，利于準確評價造影結果；但亦存在一定的局限性：由于DM大鼠病程不同，為保證治療療程相同，MCE檢測存在時間差，因此在對INS組3個亞組進行橫向比較時，目前尚無法排除時間因素的干擾，因此有待于進一步深入研究以得到更客觀的結論。

總之，胰島素早期干預能改善微血管結構，增加心肌血流灌注。MCE能敏感、準確地對DCM大鼠的心肌微循環進行評價，且安全無創、易重復檢測，可作為DCM早期診斷和動態療效監測的重要方法，具有明確的臨床指導意義。

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（本文編輯 聞 浩）

Assessment of Myocardial Perfusion in Diabetes Mellitus Rats with Insulin Intervention at Different Times by Using Myocardial Contrast Echocardiography

PurposeTo evaluate the myocardial perfusion in diabetes mellitus (DM) rats with insulin intervention at different times by myocardial contrast echocardiography (MCE)so as to explore the value of MCE in evaluating the treatment of diabetic cardiomyopathy(DCM).Materials and MethodsIn this prospective study, 90 rats were randomly divided into normal control (NC) group, DM group and insulin intervention (INS) group, with 30 rats in each group. After the DM models were established, the INS group was then divided into three subgroups of A, B and C treated with insulin intervention at 0, 4 and 8 weeks respectively and further treated continuously for 12 weeks. The NC and DM groups were also randomly divided into three subgroups and fed synchronously just as the INS group but without insulin intervention. At the end of 12, 16 and 20 weeks after modeling, the rats in each subgroup were examined by MCE. The changes of myocardial blood volume (A),blood velocity (β) and blood fl ow (A×β) were analyzed, and the myocardial tissues were also collected for pathological examination.ResultsA, β and A×β were increased in INS group compared with DM group (P＜0.05). Compared with NC group, the values of INS group including A×β in A subgroup, A and A×β in B subgroup, A, β and A×β in C subgroup were decreased (allP＜0.05). In INS group, there was no difference in the three values of myocardial blood between A and B subgroup (P＞0.05), but A and A×β were lower in C subgroup than those in A subgroup (P＜0.05). On pathology, the thickness of capillary basement membrane of INS group improved compared with DM group; the capillary density of INS group increased compared with DM group, but there was signi fi cant difference only in A subgroup (P＜0.05).ConclusionEarly insulin intervention can improve myocardial microvascular structure and increase myocardial blood fl ow. MCE can be used to evaluate the myocardial microcirculation of DCM rats sensitively and accurately, which can be used as an important method for early diagnosis and dynamic monitoring of DCM with clinical signi fi cance.

Diabetes complications; Cardiomyopathies; Insulin; Echocardiography;Contrast media; Myocardial reperfusion; Microcirculation; Disease models, animal; Rats,Sprague-Dawley

1. 西安市兒童醫院超聲科 陜西西安710003

張 軍

國家自然科學基金項目（81271580）。

2016-12-08

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.06.002

2017-02-27

2. 第四軍醫大學西京醫院超聲科 陜西西安710032

Department of Ultrasound, Xijing Hospital,the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China

Address Correspondence to:ZHANG Jun

E-mail: zhangjun@fmmu.edu.cn

R445.1；R587.1