川芎轉錄組SSR分析與ESTSSR標記的開發

袁燦　彭芳　楊澤茂　鐘文娟　牟方生　龔一耘　戢沛城

[摘要] 該研究通過組裝川芎根轉錄組數據獲得24 422個unigene，隨后對得到的unigene進行了SSR檢測，共檢測到 4 073個SSR位點。對檢測到的ESTSSR進行特征分析，結果顯示單核苷酸重復最多，占41.0%。SSR所在序列功能注釋結果顯示在Nr中有2 201條序列能夠被注釋，同時SSR所在序列還被注釋到49個GO分類和242個KEGG代謝通路中。利用SSR檢測結果進行了ESTSSR標記開發，合成其中235對引物進行驗證，74對擴增效果較好。利用74對ESTSSR引物對34個川芎資源進行遺傳多樣性分析，結果顯示收集的川芎資源多樣性較好，UPGMA聚類顯示川芎資源分為兩大類，聚類結果表現出一定的地域性，PCoA分析與UPGMA聚類結果類似。該研究首次對川芎進行ESTSSR分析和標記開發，對推動川芎資源遺傳多樣性研究、品種純度檢測、基因定位和分子育種等具有重要意義。

[關鍵詞] 川芎； ESTSSR； 功能注釋； 標記開發； 遺傳多樣性

ESTSSR identification， markers development of Ligusticum chuanxiong

based on Ligusticum chuanxiong transcriptome sequences

YUAN Can1， PENG Fang1， YANG Zemao2， ZHONG Wenjuan1， MOU Fangsheng1，

GONG Yiyun1， JI Peicheng1， PU Deqiang1， HUANG Haiyan1， YANG Xiao1*， ZHANG Chao1*

（1. Industrial Crop Research Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610300， China；

2. Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， China）

[Abstract] Ligusticum chuanxiong is a wellknown traditional Chinese medicine plant. The study on its molecular markers development and germplasm resources is very important. In this study， we obtained 24 422 unigenes by assembling transcriptome sequencing reads of L. chuanxiong root. ESTSSR was detected and 4 073 SSR loci were identified. ESTSSR distribution and characteristic analysis results showed that the mononucleotide repeats were the main repeat types， accounting for 41.0%. In addition， the sequences containing SSR were functionally annotated in Gene Ontology （GO） and KEGG pathway and were assigned to 49 GO categories， 242 KEGG pathways， among them 2 201 sequences were annotated against Nr database. By validating 235 ESTSSRs，74 primer pairs were ultimately proved to have high quality amplification. Subsequently， genetic diversity analysis， UPGMA cluster analysis， PCoA analysis and population structure analysis of 34 L. chuanxiong germplasm resources were carried out with 74 primer pairs. In both UPGMA tree and PCoA results， L. chuanxiong resources were clustered into two groups， which are believed to be partial related to their geographical distribution. In this study， ESTSSRs in L. chuanxiong was firstly identified， and newly developed molecular markers would contribute significantly to further genetic diversity study， the purity detection， gene mapping， and molecular breeding.

[Key words] Ligusticum chuanxiong； ESTSSR； functional annotation； development of molecular marker； genetic diversityendprint

川芎Ligusticum chuanxiong為傘形科藁本屬藥用植物，始載于《神農本草經》[1]，以其干燥根莖入藥，是我國傳統大宗中藥材。四川的彭州和都江堰為川芎道地產區[23] 。其味辛、性溫，有活血行氣、祛風止痛功效，用于治療頭痛、風濕、月經不調等。

近年來，川芎活性成分、藥理藥效研究較多，已分離出阿魏酸、藁本內酯[47]和多糖[8]等多種有效成分，具有擴張血管、抗血小板聚集和血栓形成、鈣拮抗等作用。然而川芎遺傳多樣性、DNA指紋圖譜、基因定位、遺傳圖譜構建、分子育種等研究卻鮮有報道。川芎中能夠用于上述研究的分子標記甚少，僅一些通用引物如RAPD[9]，ISSR[1011]，ITS[1213]等，極大的限制了川芎功能基因定位、分子育種等相關研究。

微衛星序列又稱簡單重復序列（SSR）、短串聯重復序列，由若干個串聯重復單元組成，每單元含1～10個核苷酸，廣泛分布在真核生物基因組中[14]。SSR具有標記之間密度大、材料間多態性好、易擴增、重復性高等優點[1516]，已在水稻[17]，玉米[18]，小麥[19]等作物的分子育種等研究上廣泛應用。隨著EST數據庫不斷豐富和高通量測序技術發展，ESTSSR在藥用植物上也被大量開發和應用[20]，已有紅花[21]、丹參[22]、黨參[23]、人參[24]、西洋參[25]、金銀花[26]等開發了ESTSSR，這些標記逐漸代替通用引物應用于藥用植物遺傳多樣性、基因定位、道地性鑒定等研究。本研究對川芎根轉率組測序數據拼接組裝，對unigene進行SSR位點檢測，對檢測到的ESTSSR進行分布規律等特征分析，同時對SSR所在序列進行功能注釋和代謝通路分析。隨后利用SSR檢測結果進行ESTSSR標記開發并驗證其有效性，利用效果較好的標記對都江堰、彭州等主產地進行了川芎遺傳多樣性檢測、聚類分析、PCoA分析、群體結構分析。旨在后續川芎基因定位、遺傳作圖、品種標準化、分子育種等研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 數據來源 材料為彭州、都江堰等地收集的川芎資源34份（表1），統一種植于四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所青白江基地。測序數據來源于NCBI SRA數據庫（SRX621358）。

1.2 原始測序數據質量查看、拼接和ESTSSR 統計 用FastQC查看測序數據的質量信息[Q=-10log10（e），e為測錯的概率，如Q10時，e=1/10]，利用Trinity[27]對clean data進行組裝，利用MISA對得到的unigene進行SSR統計（檢測標準為單堿基重復≥10，二堿基重復≥6，三堿基重復≥5，四堿基重復≥5，五堿基重復≥5，六堿基重復≥5）。

1.3 SSR序列注釋 利用BLAST+（ncbiblast2.2.28+，evalue<1e-5）[28]將SSR所在的unigene序列與Swissprot，TrEMBL，Nr，Nt，CDD數據庫進行比對注釋，同時利用hmmscane將unigene與Pfam[29]數據庫進行比對注釋（evalue=0.01）。最后利用CDD和GO比對結果將unigene進行KOG和GO分類[30]，利用KAAS[31]將unigene比對KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫對SSR所在的unigene進行代謝通路映射分析。

1.4 ESTSSR 引物設計與驗證 利用Primer 3和MISA運行結果進行SSR引物的設計（設計參數為GC量30%～70%， Tm 57～59 ℃，引物長度18～23 bp， 預期擴增產物長度80～300 bp），隨機挑選部分引物由合成。利用CATB法提取川芎DNA，利用分光光度計檢測DNA質量，PCR擴增體系[Taq酶（5 U·μL-1） 0.2 μL、引物（10 mmol·L-1）2 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1） 2 μL，10×Buffer（25 mmol·L-1） 2 μL，ddH2O 11.8 μL]。在PCR 產物中加入5 μL 的dilution buffer，最后一孔加25 μL DNA Ladder（30～1 500 bp），30～1 500 bp 分離膠進行毛細管電泳，利用毛細管電泳結果分析軟件PROSizeTM分析數據，自動生成結果：有條帶的讀數為“1”，無條帶讀數為“0”。

1.5 數據的分析與處理 利用Popgene進行遺傳多樣性分析，分別計算Nei指數（遺傳相似系數）、Shannon指數、平均有效位點數。利用軟件NTSYS進行聚類分析和PCoA，聚類分析采用按非加權配對法（UPGMA）進行，并計算GS值。利用STRUCTURE計算群體結構，不作數迭代設為10 000，將不作數迭代后的Markov Chain Monte Carlo（MCMC）設為100 000，K取值范圍1～12，10次獨立運算重復，根據Evanno等[32]的算法利用STRUCTURE HARVESTER計算ΔK。

2 結果與分析

2.1 數據的下載和拼接 從NCBI上下載川芎根轉錄組數據，合計13 717 243個reads，1.1 Gb數據。通過FastQC查看測序結果，所下載數據為去接頭和去低質量讀序的clean data，所有位置測序質量四分位數均高于10、中位數均高于25，A/T，C/G未出現分離現象。利用Trinity進行組裝，共拼接出50 212個轉錄本，24 422個unigene，contig N10的長度為1 182 bp，contig N50的長度600 bp，平均長度616.86 bp，最長unigene為3 899 bp，最短unigene為401 bp，所有轉錄本平均GC量為40.78%。

2.2 ESTSSR的檢測和注釋 利用MISA腳本對拼接得到unigene進行SSR位點檢測。結果顯示共檢測到4 073個SSR位點，3 602個unigene含有SSR位點，含SSR的unigene占unigene總數的7.17%，檢測SSR頻率為8.11%（檢測出的SSR數目與unigene數目之比），平均7 604 bp 1個SSR（unigene長度與SSR次數之比），其中410個unigene含有2個或2個以上的SSR位點，224個unigene含有2種或2種以上的SSR類型。endprint

將含有SSR的unigene序列比對Nr和Nt數據庫進行注釋，結果顯示2 201個unigene在Nr數據庫中具有同源匹配信息，782個unigene在Nt數據庫具有同源匹配信息，分別占比對序列的61.1%，21.7%。在與Nr數據庫進行同源比對時，比對最多的物種為胡蘿卜，共計1 655條，占比對序列的45.9%。同時將unigene與SwissProt（蛋白數據庫）、TrEMBL、Pfam（蛋白結構域注釋分類）、CDD數據庫進行比對和注釋，注釋結果顯示分別有1 302，2 009，1 110，1 318個基因被注釋，占比對序列的36.2%，55.8%，30.8%，36.6%。

隨后將含有SSR的unigene按GO（Gene Ontology）和KOG（Eukaryotic Orthologous Groups of proteins）分類系統進行分類（圖1）。SSR所在序列共計分為25個KOG類，最多一類為蛋白轉錄后修飾139個，其次為一般功能預測118個，最少的一類為細胞運動1個，其次為未知蛋白2個。在GO分類中，將unigene分為細胞組分、分子功能和生物學過程3類。在GO分類中，進一步將3大功能細分為49個小類。在生物學過程中細胞過程最多（25.6%），生物附著過程最少（0.06%）；細胞組分中細胞部分最多（28.8%），細胞外基質最少（0.03%）；分子功能中結合功能最多（23.2%），最少的為通道調節激活（0.03%）。同時對unigene進行了KEGG注釋（圖1），共計1 271個unigene在KEGG中能夠被注釋，注釋到242個代謝通路，分為30個亞組。通過對代謝通路分析發現其中最多映射到的為剪切體代謝通路，共計38個基因?；诖ㄜ旱乃幱锰匦钥疾炝薑EGG中一些活性成分相關的代謝通路注釋結果，結果顯示本研究共有28條序列注釋到萜類骨架生物合成、類苯基丙烷生物合成、黃酮類生物合成、固醇類生物合成等7個代謝通路中。

對全部注釋的數據庫結果進行比對分析發現，543個unigene在4個數據庫中都有注釋（圖1），345，24，111條序列在3個數據庫中被注釋。在KEGG中具有注釋的序列，都能在Nr數據庫中得到注釋。

2.3 ESTSSR特征和分布規律分析 根據檢測結果對SSR重復單元進行特征分析：從重復單元的組成數量分析發現，單核苷酸重復到六核苷酸重復全都含有。出現頻率最高為單核苷酸重復，占總SSR的41.0%，其次為二核苷酸，占總SSR的38.5%，五核苷酸和六核苷酸重復最少，2種核苷酸共計占所有核苷酸總數的1.91%（圖2）。

從重復單元的組成堿基類型分析發現，共計85種不同組成的重復單元，其中單核苷酸重復有2種、二核苷酸重復有4種， 三、四、五、六核苷酸重復基元分別有10，23，22，24種（表2）。

重復的92.6%；二核苷酸中CG/CG最少，AG/CT最多占總SSR的20.5%，占二核苷酸重復的55.0%；三核苷酸中ACG/CGT重復最少，ATC/GAT重復最多（表3）；四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸數量每種重復單元數量都較少，四核苷酸中ACAT/ATGT重復最多，五核苷酸中AAAAG/CTTTT和ACCCG/CGGGT重復最多，六核苷酸中ACCTCC/GGAGGT和AGCTCC/GGAGCT重復最多。

對重復單元的重復次數進行分析發現，單核苷酸重復中，10次單核苷酸重復最多占單核苷酸重復的45.7%；二核苷酸重復中，6次二核苷酸重復最多占二核苷酸重復的38.5%；三核苷酸重復中，5次三核苷酸重復最多占三核苷酸重復的64.4%，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復中都是4次重復最多（圖3）。

2.4 ESTSSR引物驗證與川芎資源遺傳多樣研究 引物設計結果顯示2 616條unigene序列能夠設計引物，占含有SSR uingene序列的72.6%，本研究共計出2 765對引物。合成其中235對進行有效性驗證。通過毛細管電泳，共得到74對SSR引物擴增帶譜清晰，大小在100～300，適合用于后續研究。

利用上述74對引物對從彭州、都江堰等道地產區收集的川芎栽培資源進行遺傳多樣性分析，74對引物共擴增得到多態性條帶208條。利用Popgene軟件計算各位點遺傳多樣性指數，有效等位基因數為1.48，Nei多樣性指數0.28，Shannon信息指數0.43，結果表明34份川芎資源具有較高的遺傳多樣性。

通過聚類分析發現收集的川芎資源GS值在0.58～0.91，在GS等于0.59時被分為兩大類（Ⅰ，Ⅱ）（圖4）。第一類包含7個資源材料，收集于都江堰、什邡、新都、彭州，各個資源間平均GS 0.76，最小GS 0.49，這一支聚類較為分散，材料間聚類關系和地理關系不大。第二類包含27個資源材料，收集于都江堰、彭州、崇州、什邡、彭山等地，各個資源間平均GS 0.75，最小GS 0.57，其中來源于彭州的川芎主要集中于Ⅱ類中的Ⅱ1分枝中，都江堰川芎聚類則分散在多個類群。同時對34份川芎資源進行了PCoA分析，PCoA分析結果與NTSYS一致性較高（圖5）。

通過對收集的川芎資源進行群體結構分析，采用ΔK最大值的方法尋找最優K值，根據Evanno計算法得到ΔK值，在K=3時得到ΔK最大值126.7（圖6），34份川芎資源被分成3組。其中第一組與NTSYS聚類結果類似，僅一份來源彭州敖平的綠色莖桿川芎聚類結果有差異，同時這一組分類與PCoA分析結果一致性較高（圖5）。第二組主要來源于彭州川芎，也包括2份都江堰川芎資源。第三組包含資源較多，主要來源于彭州，都江堰資源僅3個，在新產區彭山、什邡收集的少量資源也在第三組里。

3 討論

3.1 藥用植物SSR標記的開發 最早的SSR標記開發有包括文庫篩選法、磁珠富集法、省略篩庫法等，隨著數據庫的豐富，許多研究者也基于數據庫開發相應的SSR[33]。近年來高通測序技術的發展和二代測序成本的降低，SSR開發軟件的更新，使SSR標記開發簡易、高效[34]。藥用植物SSR也不斷被開發和應用，鄧科君等[22]利用丹參EST數據庫開發丹參ESTSSR，并利用該標記進行了丹參種屬間親緣關系分析。謝明璐等[35]利用磁珠富集法開發了60對石斛SSR標記，并應用于石斛種質純度檢測。李炎林等[36]利用轉錄組數據進行紅豆杉ESTSSR標記的開發，同時利用這些標記進行了紅豆杉遺傳圖譜構建。本研究首次對川芎進行SSR標記開發，共計得到4 073個SSR位點，開發出2 765條SSR序列引物，隨機選擇235對進行驗證，31.5%的引物序列擴增效果較好。新開發的標記可用于川芎資源多樣性檢測、系統發育樹構建、DNA指紋圖譜構建、品種純度檢測、遺傳作圖、基因定位等研究。endprint

3.2 川芎ESTSSR分布與特征分析 川芎ESTSSR檢出頻率為1/7 604，高于擬南芥（1/13 830）、楊樹[37]（1/14 000）、水稻[38]（1/11 810）、小麥[19，38]（1/15 600）、棉花[39]（1/14 800），略低于大豆[38]（1/7 400）、茶樹[40]（1/3 680）；與其他藥用植物相比，川芎ESTSSR的含量處于中等水平，低于模式藥用植物丹參[22]（1/2 100）、冬凌草[41]（1/3 517）、番紅花[42]（1/5 670）、金銀花[26]（1/4 050）、人參[24]（1/5 700）、黨參[23]（1/4 520），與西洋參[25]（1/7 500）、野三七[43]（1/7 750）相當，高于紅豆杉[36]（1/18 010）、杜仲[44]（1/11 610）、紅景天[45]（1/8 520）、藏茵陳川西獐牙菜[46]1 /（12 600）。其中川芎、野三七、西洋參三者的ESTSSR含量接近，可能與三者同屬于傘形目有關。西洋參、野三七與人參同屬于人參屬，人參ESTSSR出現頻率卻較高，前人研究表明ESTSSR的檢測頻率還與檢測參數設置、基因組中轉錄比例、基因組大小、基因組低拷貝序列等[22， 47]因素有關。

大多數植物ESTSSR以二、三核苷酸重復為主要類型，藥用植物中藏紅花[42]、紅花[21]、紅景天[45]、黃花蒿[48]、刺梨[49]等以三核苷酸為主，丹參[22]、金銀花[26]、杜仲[44]、燈盞花[50]等以二核苷酸為主，但川芎ESTSSR以單核苷酸（45.7%）和二核苷酸重復（38.5%）為主（表3），與文獻報道的3種人參屬植物（人參、三七、西洋參）ESTSSR結果[51]相似。單核苷酸重復以A/T為主，二核苷酸重復以AG/CT為主，去掉單核苷酸重復后，二核苷酸重復占65.3%，這一特征與山核桃ESTSSR重復基元特征一致較高[52]，大多數藥用植物二核苷酸重復也以AG/CT為主，由于三核苷酸重復種類較多，在各個植物間變異也較大，川芎ESTSSR三核苷酸重復以ATC/GAT、AAG/CTT為主，這與丹參[22]、人參[24]、藏紅花[42]等三核苷酸重復特征基本一致。

3.3 川芎ESTSSR功能注釋 對SSR所在序列與Nr，Nt，TrEMBL，Pfam，CDD數據庫進行比對和注釋， 結果顯示SSR序列參與的功能較多，有轉錄調控、ATP酶催化、DNA修復等。通過對SSR進行KOG分類，結果顯示983條序列具有KOG分類，這些SSR參與功能最多是蛋白轉錄后修飾，其中37條序列參與次生代謝。GO注釋結果顯示ESTSSR所在的序列被分為49類，其中分子功能中最多為結合功能，其次為催化活性。在細胞組分分類中細胞部分比例最多，生物學過程分類中細胞過程最多，這一結果與紅花SSR[53]和黃花蒿ESTSSR[50]所在序列GO分類結果較為相似。通過KEGG分析，SSR所在序列共計分為242個代謝通路，其中有6條序列注釋到類苯基丙烷生物合成代謝通路，與此代謝通路相關的阿魏酸為川芎主要活性成分，有7條序列注釋到與川芎另一活性成分多糖合成相關的N聚糖生物合成途徑。本研究所得到SSR所在序列注釋信息和與活性成分相關基因緊密連鎖標記的開發，將有助于川芎的功能基因研究和遺傳改良。

3.4 川芎資源遺傳多樣性和聚類分析 從川芎傳統道地產區彭州、都江堰以及新興產區彭山、什邡共收集川芎資源34份，資源多樣性豐富聚類分析顯示都江堰和彭州資源雖然沒有明顯的界限，但彭州收集的資源在聚類上表現出一定的地域關系，大部分收集的彭州資源都被聚集在Ⅱ1中，PCoA分析結果與聚類分析結果一致性較高。新興產區彭山、什邡等地資源與老產區差異不大，可能是因為新興產區苓種主要來源于老產區。近年來生產調查發現都江堰川芎種植面積越來越少[54]，本研究收集于都江堰產區的資源，對川芎基因資源的保存和川芎品種選育等都有重要意義。

[致謝] 本研究的資源收集得到成都中醫藥大學蔣桂華教授和馬逾英教授的大力支持和幫助。

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[責任編輯 呂冬梅]endprint