乳香沒藥揮發油對川芎中阿魏酸促透機制的研究

管詠梅　陶玲　朱小芳　臧振中　金晨　陳麗華

[摘要] 該研究擬探索乳香沒藥揮發油對川芎的促透機制，觀察乳香沒藥揮發油對角質層微觀及分子結構的影響。通過測定川芎中阿魏酸在乳香沒藥揮發油作用下的角質層/介質分配系數，采用掃描電鏡觀察乳香、沒藥揮發油對皮膚角質層結構的影響，利用傅里葉變換紅外光譜儀考察乳香、沒藥揮發油對角質層內角蛋白和脂質的分子結構的影響，來探索乳香沒藥揮發油對角質層微觀及分子結構的影響。研究結果顯示乳香、沒藥揮發油可使阿魏酸在角質層與介質分配增強，使角質層有規律的，整齊緊密堆積排列的疊瓦式結構受到一定程度的破損，同時有部分表皮鱗片向上翻起，出現局部脫落現象。另乳香、沒藥揮發油使角質層脂質的CH2伸縮振動峰和角質層角蛋白的酰胺伸縮振動峰均發生了相對的位移，表明，乳香、沒藥揮發油可能是使角質層中脂質及角蛋白的構象發生改變，增加角質層脂質雙分子層的流動性，改變有序致密結構，來達到使皮膚的通透性增加，屏障作用降低的效果。由此可知，乳香沒藥可能通過增加藥物在角質層分配，改變皮膚角質層結構來達到促滲效果。

[關鍵詞] 乳香沒藥揮發油； 中藥揮發油； 經皮給藥； 促透機制； 角質層微觀結構

Effects of Frankincense and Myrrh essential oil on transdermal

absorption of ferulic acid in Chuanxiong

GUAN Yongmei1，2， TAO Ling1， ZHU Xiaofang1， ZANG Zhenzhong1， JIN Chen1*， CHEN Lihua1

（1.Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine under Ministry of Education， Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China；

2. Jiangxi Province Research Center of Extracts and Preparations Engineering Technology of

Traditional Chinese Medicine， Yichun 336000， China）

[Abstract] The aim of this paper was to explore the effects of Frankincense and Myrrh essential oil on transdermal absorption， and investigate the mechanism of permeation on the microstructure and molecular structure of stratum corneum. Through the determination of stratum corneum/medium partition coefficient of ferulicacid in Chuanxiong influenced by Frankincense and Myrrh essential oil， the effects of volatile oil of frankincense and Myrrh on the the microscopic and molecular structure of stratum corneum were explored by observation of skin stratum corneum structure under scanning electron microscopy， and investigation of frankincense and myrrh essential oil effects on the molecular structure of keratin and lipids in stratum corneum under Fourier transform infrared spectroscopy. The results showed that the oil could enhance the distribution of ferulic acid in the stratum corneum and medium， and to a certain extent damaged the imbricate structure of stratum corneum which was originally regularly， neatly， and closely arranged； some epidermal scales turned upward， with local peeling phenomenon. In addition， frankincense and myrrh essential oil caused the relative displacement of CH2 stretching vibration peak of stratum corneum lipids and amide stretching vibration peak of stratum corneum keratin， indicating that frankincense and myrrh essential oil may change the conformation of lipid and keratin in the stratum corneum， increase the bilayer liquidity of the stratum corneum lipid， and change the orderly and compact structure to increase the skin permeability and reduce the effect of barrier function. It can be concluded that Frankincense and Myrrh essential oil can promote the permeation effect by increasing the distribution of drugs in the stratum corneum and changing the structure of the stratum corneum.endprint

[Key words] Frankincense and Myrrh essential oil； traditional Chinese medicine essential oil； transdermal delivery system； penetration mechanism； stratum corneum microstructure

經皮給藥是常用給藥途徑之一，具有給藥方便、可避免首關效應、長時間維持恒定血藥濃度等用藥優勢，基于這些優勢，經皮給藥擁有巨大的應用前景。但皮膚的屏障作用，尤其是皮膚角質層阻止了大多藥物滲透進入皮膚組織，限制藥物的經皮吸收，影響藥物生物利用度，故藥物的促滲研究成為當前研究熱點[13]。中藥揮發油大多具有良好的透皮吸收促進效果[45]，課題組[6]通過體外滲透動力學曲線及相關經皮滲透參數發現，乳香、沒藥揮發油配伍前后對川芎指標成分阿魏酸均具有一定的促滲透作用，且混合提取所得的揮發油促滲作用最強，單提混合所得揮發油促進作用倍數小于兩者單用，因此研究乳香、沒藥揮發油對川芎的促透作用及其機制或可闡述其配伍意義，對于中藥揮發油在經皮給藥的應用研究也至關重要。本研究擬采用掃描電鏡直觀觀察乳香、沒藥揮發油對皮膚角質層結構的影響，同時利用傅里葉變換紅外光譜技術考察乳香、沒藥揮發油對角質層內角蛋白和脂質的分子結構的影響，期望闡述乳香沒藥揮發油對皮膚角質層作用的促透機制。

1 材料

QYC200恒溫搖床（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；SIGMA318K高速冷凍離心機（德國SIGMA公司）；DN24A干式氮吹儀（上海比郎儀器有限公司）；Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（45 kHz，240 W，昆明市超聲儀器有限公司）；ESJ1824型電子分析天平（1/10萬，沈陽龍騰電子有限公司）；XW80A渦旋混合器（上海青浦滬西）； Quanta 250型掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；K750X型冷凍干燥儀（英國Quorum公司）；specturm two型衰減全反射傅利葉變換紅外光譜儀（美國Perkin Elmer公司）。

乳香飲片（批號150914，產地云南）、沒藥飲片（批號151227，產地云南） 、川芎飲片（批號150805，產地四川），均購自江西樟樹藥材市場，江西中醫藥大學中藥鑒定教研室鄧可眾教授鑒定為正品；乳香、沒藥揮發油采用 2015 年版《中國藥典》附錄揮發油提取甲法提取，得淡黃油狀溶液，無水硫酸鈉脫水后密封避光保存；氮酮（純度97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號140618）；阿魏酸對照品（純度>98%，成都普菲德生物技術有限公司，批號151103）；1，2丙二醇（西隴化工股份有限公司，批號151123）；胰蛋白酶（牛胰，上海瑞永生物科技有限公司）；戊二醛（純度25%，天津市光復精細化工研究所，批號150316）；鋨酸（純度2%，蘭州中科凱特科工貿有限公司）；冰醋酸（西隴科學股份有限公司，批號160517）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；水為純凈水，其他試劑均為分析純。

SPF級，健康KM小鼠，雄性，體質量（20±2） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證編號SCXK（湘）20130004。

2 方法

2.1 乳香沒藥揮發油對川芎向角質層分配的影響

2.1.1 離體小鼠皮膚角質層的制備 取健康雄性小鼠，眼用彎剪剪去其腹部毛發，脫頸椎處死，用剪刀剝取其腹部無毛皮膚，并小心去除皮下脂肪及黏液組織，用生理鹽水漂洗至無渾濁，清洗干凈。室溫下，將制得的小鼠腹皮置于胰蛋白酶溶液（0.4%）中處理10 h，接著用棉簽小心分離皮膚角質層，制備的皮膚角質層用純水清洗干凈，備用。

2.1.2 川芎中阿魏酸角質層/介質分配系數的測定 取干燥小鼠皮膚角質層，剪刀剪碎，稱取約10 mg置于勻漿器中，加入生理鹽水并勻漿，再將勻漿液于氮氣下吹干，加入1 mL相應濃度促透劑的含藥溶液復溶，實驗分別設置溶劑組（丙二醇水溶劑系統[78]）、乳香沒藥揮發油組及氮酮組（各組濃度選擇同體外透皮實驗），超聲30 min，渦旋混勻，置于37 ℃恒溫水浴平衡12 h，再于離心機1萬 r·min-1，離心10 min，離心后取上清液適當稀釋，按照建立的液相方法進樣，測定藥物含量，每組平行操作3次。

2.2 掃描電鏡直觀觀察乳香、沒藥揮發油對皮膚角質層結構的影響[9]

2.2.1 角質層分組與給藥 將2.1.1項下制備好的角質層分為4 cm2大小的7小樣分別放入7個具塞西林瓶中，空白組（空瓶），溶劑組（1，2丙二醇蒸餾水8∶2），陽性對照組（3%氮酮），實驗組（3%乳香揮發油，3%沒藥揮發油，3%乳香沒藥單提混揮發油，3%乳香沒藥混提揮發油，各濃度設置同體外透皮實驗），其中陽性對照組和實驗組處理溶液均用1，2丙二醇蒸餾水8∶2溶劑系統配制。向西林小瓶中分別加入相應的實驗處理溶液10 mL，在室溫下密封處理12 h。處理完畢后，先用pH 7.0的磷酸緩沖鹽沖洗3遍，再用生理鹽水清洗干凈，備用。

2.2.2 掃描電鏡樣品制備 ①初固定：給藥完畢后，取得的角質層用無水乙醇沖洗6次，每次沖洗30 s，以洗凈角質層表面殘留的藥液，用濾紙吸干其表面殘留的溶液。將處理好及未處理的皮膚角質層（共7塊）固定于2.5%戊二醛溶液中，常溫避光固定4 h。②漂洗：將固定好的皮膚角質層樣品在0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液漂3次，每次漂洗15 min，（為充分清洗掉皮膚上殘留的醛，清洗時可在燒杯中震蕩）。③后固定：將漂洗后的角質層樣品放置于1%鋨酸中進行再固定，常溫避光固定2 h。④再漂洗：將后固定好的角質層樣品放置在0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液漂洗3次，每次漂洗15 min，再用濾紙吸干其表面殘留的清洗液。⑤真空冷凍干燥法干燥：即溫度梯度干燥，以0.05 ℃的速率升溫，-20 ℃，8 h；-10 ℃，6 h；0 ℃，6 h；10 ℃，6 h；15 ℃，5 h。⑥離子濺射噴金：利用離子濺射儀將干燥后的皮膚樣品在表面濺射一層金屬粒子，形成薄薄的金屬膜。⑦掃描電鏡對各組皮膚進行拍照，觀察各組皮膚表面的形態學變化（1 600倍）。endprint

2.3 傅里葉變換紅外光譜技術考察乳香、沒藥揮發油對角質層內角蛋白和脂質的分子結構的影響

2.3.1 傅利葉變換紅外光譜條件 室溫20～25 ℃，相對濕度45%，反射棱鏡（ZnSe），入射角 45°，掃描次數64次，分辨率4 cm-1，掃描范圍4 000～400 cm-1。

2.3.2 傅利葉變換紅外光譜樣品制備與檢測 將2.1.1項下制備好的角質層分為4 cm2大小的7小樣分別放入7個具塞西林瓶中，空白組（空瓶），溶劑組（1，2丙二醇蒸餾水80∶20），陽性對照組（3%氮酮），實驗組（3%乳香揮發油；3%沒藥揮發油；3%乳香沒藥單提混揮發油；3%乳香沒藥混提揮發油，各濃度設置同體外透皮實驗），其中陽性對照組和實驗組處理溶液均用1，2丙二醇蒸餾水80∶20溶劑系統配制。向西林小瓶中分別加入相應的實驗處理溶液10 mL，在室溫下密封處理12 h。處理完畢后，先用pH 7.0的磷酸緩沖鹽沖洗3遍，再用生理鹽水清洗干凈，放置真空干燥箱中37 ℃脫水干燥。將制備好的各組角質層樣品采用ATRFTIR光譜儀進行掃描。

3 結果

3.1 川芎中阿魏酸角質層/介質分配系數的測定結果

藥物在角質層與介質的分配系數K=C角質層藥物/C上清液藥物，得川芎中阿魏酸在不同促透劑作用條件下，其在角質層與介質中的分配系數，見表 1，其中在氮酮作用下，川芎中阿魏酸角質層/介質分配系數顯著性增加，與溶劑組比較，其在角質層與介質分配增強倍數可達到2.72。乳香、沒藥揮發油表現出類似氮酮的增加川芎中阿魏酸角質層/介質分配系數的作用，但作用的強度較弱于氮酮，其使川芎中阿魏酸在角質層與介質分配增強倍數分別可達到2.31，2.15。

3.2 掃描電鏡結果

正常小鼠皮膚角質層表面平坦、光滑，有少量的分泌物附著，并且角質層細胞呈疊瓦式結構有規律地，整齊緊密地堆積排列，見圖1，而這種結構可能正是使皮膚具備良好滲透性屏障的原因之一。不同促透劑作用于小鼠皮膚后，其對皮膚角質層微觀形態學的變化見圖2。與正常皮膚比較，A組（溶劑）皮膚角質層仍呈疊瓦式結構有規律地，整齊緊密地堆積排列，但是表面出現一定的褶皺，這可能是溶劑1，2丙二醇的作用。與溶劑組皮膚比較，B組（氮酮）皮膚角質層有規律的，整齊緊密堆積排列的疊瓦式結構有一定程度的松動，形成了部分小小的間裂隙，而且其表面的褶皺明顯增多加深。然而，C～F（不同條件的揮發油）4組的皮膚角質層與溶劑組的比較，角質層有規律的，整齊緊密堆積排列的疊瓦式結構受到一定程度的破損，同時有部分表皮鱗片向上翻起，角質層出現局部脫落現象。因此，4組揮發油對皮膚角質層微觀形態學變化的作用類似，但作用強度稍大于氮酮。

3.3 乳香、沒藥揮發油對角質層內角蛋白和脂質的分子結構的影響的結果

空白組角質層結構的脂質OH特征振動吸收為3 283.65 cm-1，C=O特征振動吸收為1 741.78 cm-1，CH2特征不對稱振動吸收為2 917.81 cm-1，CH2特征對稱振動吸收為2 850.25 cm-1，酰胺Ⅰ特征振動吸收為1 645.80 cm-1，酰胺Ⅱ特征振動吸收為1 538.82 cm-1，見表2，3。溶劑對照組的各個特征振動吸收峰與空白組的比較無統計學差異，明確所選溶劑系統不會對皮膚角質層產生影響。氮酮陽性對照組的各個特征振動吸收峰與空白組的比較，其中CH2不對稱振動吸收峰波數（2 922.85 cm-1）和CH2對稱振動吸收峰波數（2 853.23 cm-1）發生3 cm-1以上波數的相對位移，其他特征振動吸收峰的波數位移無明顯變化，表明氮酮可能通過改變角質層脂質結構的構象來擾亂其致密有序排列的結構。給藥組（乳香揮發油，沒藥揮發油，乳香+沒藥揮發油，乳沒藥對揮發油）處理的角質層結構的脂質各個特征振動吸收峰與空白組的比較，其中CH2不對稱振動吸收峰波數（2 923 cm-1左右）和CH2對稱振動吸收峰波數（2 853 cm-1左右）位移都發生了3 cm-1以上相對的藍移，而且皮膚角質層中角蛋白的酰胺振動Ⅰ峰波數（1 645 cm-1左右）發生相對的紅移，有的還出現了裂縫，酰胺振動Ⅱ峰波數（1 538 cm-1左右）未發生相對的位移，而且有乳香揮發油處理過的皮膚角質層脂質的OH特征吸收峰波數發生了4 cm-1左右相對的紅移，見圖3。上述結果表明，乳香、沒藥揮發油可能是通過改變皮膚角質層脂質、角蛋白結構的構象，擾亂其致密有序性，改善脂質的流動性，來發揮促藥經皮吸收的效果，并且乳香揮發油還可能通過水合作用來實現促藥滲透。

4 討論

近年來，中藥揮發油作為經皮給藥促透劑的研究已成熱點[1011]，促透機制的研究已成趨勢。擾亂高度有序排列的皮膚角質層結構是目前普遍認為的經皮促透劑促滲機制[12]。本文通過測定川芎中阿魏酸角質層/介質分配系數，發現乳香沒藥揮發油可增加川芎中阿魏酸角質層/介質分配系數的作用，且藥對組使川芎中阿魏酸在角質層與介質分配增強倍數可達到2.83，其作用較優于乳香（2.31）和沒藥（2.15）揮發油組，同時可見乳沒單提混合組呈現出的作用并不是乳香與沒藥揮發油簡單應用的加和，但是，乳沒單提混合組（3.81）大于藥對組（2.83）作用與課題組前期實驗結論矛盾，出現這種差異性的原因還有待進一步的實驗研究。采用掃描電鏡（SEM）拍照觀察氮酮，乳香、沒藥揮發油處理過的小鼠皮膚角質層結構的變化，發現氮酮可使皮膚角質層整齊緊密堆積排列的疊瓦式結構有一定程度的松動，形成了部分小小的間裂隙，而且其表面的褶皺明顯增多加深，而乳香、沒藥揮發油可使疊瓦式結構受到一定程度的破損，同時有部分表皮鱗片向上翻起，角質層出現局部脫落現象，故猜測乳香沒藥對皮膚角質層作用與氮酮類似，主要通過破壞角質層結構，增加皮膚通透性，降低藥物擴善阻力，來達到促滲目的，且作用更強，這也在一定程度上佐證了乳香沒藥的在臨床應用中對皮膚刺激的不良反應[13]，需嚴格控制劑量以保證用藥安全性。此外，在掃描電鏡直觀觀察乳香、沒藥揮發油對皮膚角質層結構的影響時對角質層樣品的漂洗文獻報道多用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液，樣品前處理未見報道，課題組在前期測定川芎中的阿魏酸在不同pH磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度的實驗中，發現pH 6.8可能是3種促透劑發揮經皮促透作用的較理想的皮膚生理pH，考慮到對皮膚pH的影響，故選用pH 7.0的磷酸緩沖鹽沖洗，而非常用0.1 mol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.3），至于pH對試驗結果的具體影響需進一步探索。endprint

本文另采用傅利葉變換紅外光譜測定氮酮，乳香、沒藥揮發油處理過的皮膚角質層脂質及角蛋白的結構或構象，擬從分子水平來闡述氮酮，乳香、沒藥揮發油對角質層作用的機制，發現氮酮使皮膚角質層脂質的CH2伸縮振動峰發生了位移，角質層角蛋白的酰胺伸縮振動峰未發生變化，表明氮酮可能是通過改變角質層中脂質的構象來擾亂其致密有序排列的結構，然而，乳香、沒藥揮發油使角質層脂質的CH2伸縮振動峰和角質層角蛋白的酰胺伸縮振動峰均發生了相對的位移，表明，乳香、沒藥揮發油可能是使角質層中脂質及角蛋白的構象發生改變，增加角質層脂質雙分子層的流動性，改變有序致密結構，來達到使皮膚的通透性增加，屏障作用降低的效果。然而角質層脂質是一個完整的分子結構，包括分子非極性頭區和分子極性頭區，傅利葉變換紅外光譜技術只可檢測到脂質非極性鏈的分子改變，分子極性頭區的分子構象改變難以檢測。因此，乳香、沒藥揮發油是如何改變角質層脂質整個分子的結構也需進一步的實驗研究。

乳香、沒藥在我國具有悠久的藥用歷史，但配伍機制的闡明及其新制劑技術的開發目前尚處于起步階段，而對乳香沒藥揮發油的促滲機制研究不僅可促進乳香沒藥配伍機制的研究，更可促進中藥揮發油在經皮給藥中的應用，上述結果只是從皮膚角質層最表層的結構來闡述乳香、沒藥揮發油促透作用的機制，而乳香、沒藥揮發油是如何改變皮膚角質層有序致密的結構，還需進一步的實驗研究，至于與報道的相關作用機制如拉動效應[14]、增強皮膚角質層的水合作用[15]、增加皮膚血流等的聯系也需要進一步的探索。

[參考文獻]

[1] Chen J，Jiang Q D，Chai Y P，et al. Natural terpenes as penetration enhancers for transdermal drug delivery[J]. Molecules，2016，21（12）：1709.

[2] Monti D，Egiziano E，Burgalassi S，et al. Ionic liquids as potential enhancers for transdermal drug delivery[J]. Inter J Pharm，2016， 516（1/2）：45.

[3] Sivaraman A，Banga A K. Novel in situ forming hydrogel microneedles for transdermal drug delivery[J]. Drug Deliv Transl Res，2017：7（1）：16.

[4] Herman A，Herman A P.Essential oils and their constituents as skin penetration enhancer for transdermal drug delivery：a review[J]. J Pharm Pharmacol，2015，67（4）：473.

[5] Chen J，Jiang Q D， Wu Y M，et al. Potential of essential oils as penetration enhancers for transdermal administration of ibuprofen to treat dysmenorrhoea[J]. Molecules，2015，20（10）：18219.

[6] 朱小芳，羅晶，管詠梅，等. 乳香沒藥揮發油對川芎體外透皮吸收的影響及其皮膚血流促透機制研究[J]. 中國中藥雜志，2017，42（4）：680.

[7] Lane M E.Skin penetration enhancers[J]. Int J Pharm，2013，447（1/2）：12.

[8] Lan Y，Wu Q，Mao Y Q，et al. Cytotoxicity and enhancement activity of essential oil from Zanthoxylum bungeanum Maxim. as a natural transdermal penetration enhancer[J]. J Zhejiang UnivSci B， 2014，15（2）：153.

[9] 梁慶.薄荷醇的促透作用及其機制研究[D]. 廣州：廣東藥學院，2009.

[10] 陳軍，劉培，蔣秋冬，等. 基于藥性特征的中藥揮發油透皮促滲作用規律性認識的思路與方法[J]. 中草藥，2016，47（24）：4305.

[11] 蔣秋冬，楊文國，蔡皓，等. 透皮促滲中藥揮發油的化學成分與中藥藥性關聯性研究[J]. 中國中藥雜志，2016，41（13）：2500.

[12] 張春鳳，戰偉，楊中林，等. 雙環單萜促透劑對川芎嗪透皮吸收的影響[J]. 藥學學報，2010，45（11）：1452.

[13] 楊建土.乳香沒藥的臨床不良反應及其毒性分析[J]. 中國醫藥指南，2015，13（1）：49.

[14] 李莉，韓國柱.中草藥揮發油類透皮吸收促進作用研究進展[J]. 中國新藥雜志，2008，17（11）：914.

[15] 王慧菁，張立超，張永佳，等. 川芎揮發油增加皮膚血流皮膚促透機制[J]. 中國藥學雜志，2010，45（24）：1925.

[責任編輯 孔晶晶]endprint