UPLCMS/MS同時測定桂枝茯苓膠囊中6 種三萜酸類成分的含量

馬瑩 李家春　黃文哲　王振中　蕭偉　宋亞玲　張永文

[摘要] 建立超高效液相色譜質譜聯用（UPLCMS/MS）同時測定桂枝茯苓膠囊中 6 種三萜酸類成分含量的分析方法。采用 Agilent Porosheell 120 SBC18柱（4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）；流動相為 0.1%甲酸水溶液甲醇，梯度洗脫，流速0.4 mL·min-1，柱溫 30 ℃；進樣量 5 μL。質譜條件采用電噴霧離子（ESI）源，多重反應監測（MRM）掃描，定量離子對為m/z 527.8→465.5（茯苓酸），m/z 525.6→465.6（去氫茯苓酸），m/z 483.4→337.3（去氫土莫酸），m/z 481.5→419.5（豬苓酸C），m/z 467.4→337.1（去氫齒孔酸），m/z 453.4→337.0（松苓新酸）。結果顯示，6 種三萜酸類成分在進樣質量濃度范圍內呈現良好的線性關系（r>0.996 8），精密度 RSD<6.2%；重復性 RSD<5.9%，平均回收率分別為 97.90%，100.2%，99.60%，101.7%，102.6%，103.0%。該方法準確、快速、重復性好，實現了中藥成方制劑中茯苓三萜酸類成分的定量測定，可為桂枝茯苓膠囊的質量控制提供參考方法；并為含茯苓的中藥成方制劑中建立含量測定方法提供參考。

[關鍵詞] UPLCMS/MS； 桂枝茯苓膠囊； 三萜酸； 含量測定

Simultaneous determination of six triterpenoid acids from Guizhi Fuling

capsules by UPLCMS/MS

MA Ying1， LI Jiachun2， HUANG Wenzhe2， WANG Zhenzhong2， XIAO Wei2，

SONG Yaling2， ZHANG Yongwen3*

（1. School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；

3. Center for Drug Evaluation， China Food and Drug Administration， Beijing 100038， China）

[Abstract] To establish a UPLCMS/MS method for simultaneous determination of six triterpenoid constituents （pachymic acid， dehydropachymic acid， dehydrotumulosic acid， polyporenic acid C， dehydroeburicoic acid and dehydrotra metenolic acid） in Guizhi Fuling capsules （GFC）. Chromatographic analysis was conducted on Agilent Porosheell 120 SBC18 column （4.6 mm×150 mm， 2.7 μm）， with 0.1% formic acid aqueous solutionmethanol as the mobile phase for gradient elution at a flow rate of 0.4 mL·min-1. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 5 μL. The samples were analyzed by tandem mass spectrometer with negative electrospray ionization （ESI） source， and monitored under a multiple reaction monitoring （MRM） mode， with the quantitative ion pairs m/z 527.8→465.5 （pachymic acid）， m/z 525.6→465.6 （dehydropachymic acid）， m/z 483.4→337.3 （dehydrotumulosic acid）， m/z 481.5→419.5 （polyporenic acid C）， m/z 467.4→337.1 （dehydroeburicoic acid）， m/z 453.4→337.0 （dehydrotra metenolic acid）. Six triterpenoid acids showed good linear relationships within the investigated concentration ranges （r>0.996 8）， with RSDs of precision less than 6.2%， and all RSDs of repeatability less than 5.9%. The average recovery rate was 97.90%， 100.2%， 99.60%， 101.7%， 102.6% and 103.0% respectively. The method was rapid， accurate， repeatable and could be used as a method for quantitative determination of triterpenoid acids in Chinese medicine prescriptions， providing a reference method for the quality control of Guizhi Fuling capsules and providing a reference for the content determination for Chinese medicine prescriptions containing Poria cocos.endprint

[Key words] UPLCMS/MS； Guizhi Fuling capsules； triterpenoid acids； quantitative determination

桂枝茯苓膠囊（Guizhi Fuling capsules，GFC）是我國傳統的純中藥制劑，處方源自漢代名醫張仲景的《金匱要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁和白芍五味中藥組成，具有活血化瘀、消癥的功效，用于治療婦科血瘀癥，子宮肌瘤，慢性盆腔炎，卵巢囊腫，原發性痛經等疾病[12]。

目前，GFC質量標準收載于《中國藥典》2015年版一部[3]中，其含量測定項下制定了牡丹皮中丹皮酚，白芍中芍藥苷，桃仁中苦杏仁苷的含量測定方法及含量限度，對茯苓中的三萜酸類成分未建立含量測定方法。據文獻報道[45]，茯苓三萜酸類成分具有抗炎、免疫調節等藥理作用，與GFC臨床療效相關，也被認為是其重要的有效成分[67]。由于三萜酸類成分的含量測定難度較高，迄今為止對該類成分的質量控制方面報道較少[89]。為進一步完善GFC的質量控制方法，本研究首次建立UPLCMS/MS同時測定6種三萜酸類成分含量的方法，并運用于GFC制劑的質量控制中。該方法分析速度快，專屬性強，靈敏度高，實現了在GFC中茯苓三萜酸類成分的定量測定，為完善GFC的質量控制標準提供了依據。

1 材料

LC30AD超高效液相色譜儀（日本島津公司），Analyst Software工作站，APL4000+三重四極桿質譜儀（美國AB公司）；Sartorius BSA224SCW電子分析天平（德國賽多利斯公司）；Mettler Toledo XP6電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ250DB數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；MilliQ超純水儀（美國密理博公司）。

茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、去氫齒孔酸、豬苓酸C、松苓新酸對照品，均由本實驗室自制，經面積歸一化法測定純度均>98%；銀杏內酯B對照品購自中國食品藥品檢定研究院（批號110863201209，純度>99.9%）；桂枝茯苓膠囊（GFC）由江蘇康緣藥業股份有限公司提供，規格：0.31 g×100粒/盒，批號160202，160301，160302，160401，160701，160802，170230；甲醇（德國Merck公司）、甲酸（美國ACS恩科化學公司）為色譜純，水為實驗室自制超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制

分別精密稱取茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、去氫齒孔酸、豬苓酸C、松苓新酸對照品5.059，5.161，4.528，5.470，5.219，5.083 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容，制得質量濃度分別為0.495 8，0.505 8，0.443 7，0.536 1，0.511 7，0.498 1 g·L-1的對照品儲備液，吸取各對照品儲備液適量，制得各成分質量濃度均為 10 mg·L-1的混合對照品溶液，于 4 ℃保存，備用。

2.2 內標溶液的配制

精密稱取 6.432 mg 銀杏內酯 B 于 10 mL 量瓶中，用甲醇定容，制得質量濃度為 0.642 6 g·L-1的內標溶液，精密吸取適量，制得質量濃度為 1 mg·L-1的內標溶液，4 ℃ 保存，備用。

2.3 供試品溶液的配制

取 GFC 10 粒，將內容物置研缽中研磨均勻。取細粉約 0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入乙酸乙酯溶液 50 mL，超聲處理（功率 250 W，頻率50 kHz）1 h，濾過，減壓濃縮（40 ℃）至干，用甲醇溶解定容至 25 mL量瓶中，搖勻，靜置，過 0.22 μm 微孔濾膜后備用。

2.4 色譜與質譜條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent Porosheell 120 SBC18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）甲醇（B），梯度洗脫（0.01～15 min，92% B；15～15.2 min， 92%～100% B； 15.2～20 min， 100%B； 20～20.2 min，100%～92% B； 20.2～25 min，92% B），流速 0.4 mL·min-1，柱溫 30 ℃，進樣量5 μL。

2.4.2 質譜條件 APL4000+三重四極桿串聯質譜儀，離子化方式為電噴霧離子化（ESI），負離子檢測模式，采用多反應監測離子掃描（MRM）；主要質譜參數：氣簾氣（CUR）體積流量 45 L·min-1；噴霧電壓（IS）4 500 V；脫溶劑溫度（TEM）450 ℃；霧化氣（GS1）體積流量 50 L·min-1；加熱輔助氣（GS2）體積流量 50 L·min-1。各成分的部分質譜分析參數，見表 1，混合對照品及樣品 MRM色譜圖，見圖 1。

2.5 線性關系

分別精密吸取混合對照品溶液適量，加甲醇溶液稀釋至不同質量濃度，搖勻，制得系列混合對照品溶液，分別吸取以上混合對照品溶液 500 μL，加 15 μL內標溶液，混勻，按2.4項下條件，測定峰面積，以峰面積與內標峰面積的比值（Y）對分析物質量濃度（X）進行線性回歸，繪制標準曲線，回歸方程見表2。結果表明，各成分在各自的線性范圍內具有良好的線性關系。

2.6 精密度

精密稱取同一批樣品（批號170230），按2.3項下制備 6 份供試品溶液，精密吸取 500 μL，加入甲醇 500 μL，內標 30 μL，混勻，按2.4項下色譜及質譜條件進行測定，測定各成分的峰面積，并按內標法計算各成分含量，計算日內精密度，RSD<10%，見表3；另取該樣品 6 份，連續6 d內分別同法制備成供試品溶液，并按2.4項下色譜及質譜條件進行測定，測定各成分的峰面積，按內標法計算各成分的含量，計算日間精密度， RSD<10%，見表 3，結果表明方法精密度良好。endprint

2.7 穩定性

按2.3項下制備供試品溶液，精密吸取 500 μL，加入甲醇 500 μL，內標 30 μL，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h按2.4項下色譜及質譜條件進行測定，測定各成分的峰面積，并計算各成分含量的 RSD，結果見表3，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 重復性

精密吸取同1批（批號170230）GFC樣品6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，精密吸取 500 μL，加入甲醇 500 μL，內標 30 μL，按2.4項下色譜及質譜條件進行測定，測定各成分的峰面積，并計算各成分含量的 RSD，結果見表3，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率

精密稱取茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸，豬苓酸 C，去氫齒孔酸、松苓新酸對照品適量，用甲醇配制成 1 mL含有133.5，55.50，43.05，17.30，13.50，16.50 μg的混合對照品溶液。取已知含量的 GFC 9 份，每份約0.15 g，分成3組，分別精密加入混合對照品溶液各 333 μL（低）、667 μL（中）、1 000 μL（高），分別按2.3項下制備供試品溶液后按2.4項下色譜及質譜條件測定含量，計算6種三萜酸類成分的平均回收率，結果茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫齒孔酸、松苓新酸的平均回收率依次分別為 97.90%，100.2%，99.60%，101.7%，102.6%，103.0%，RSD依次分別為 2.1%，1.9%，2.1%，2.7%，3.6%，1.7%。

2.10 樣品測定

取不同批號的樣品0.6 g，精密稱定，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.4項下色譜及質譜條件進行測定，（每批號 2 份，每份進樣 2 次），計算每粒 GFC中 6 種茯苓三萜酸類成分的含量，結果見表4。

2.11 箱線圖分析

箱線圖[10]是一種描述數據分布的統計圖，利用它可以直觀的來觀察變量值的分布情況，箱線圖主要表示變量值的中位數，1/4位數，3/4 位數等統計量。在現有的研究基礎上，引入了P來評價批次間的差異，P=CA/CB×100%，其中CA為每個批次各個化合物的含量，CB為 7 個批次各個化合物的平均含量。P越接近于100%表明批次間的差異越小，規定批次間的波動在 75%～125%是可以接受的[11]。采用 SPSS 20.0數據處理軟件對測定結果進行處理，對7個批次的GFC中6個三萜酸類成分進行分析，見圖2。結果表明，茯苓酸、去氫茯苓酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、去氫齒孔酸和松苓新酸的P接近 100%，表明批次間差異性小，去氫茯苓酸與去氫齒孔酸分別有一個異常值，但波動在75%～125%，故不影響整體的質量。由此可以得出不同批次 GFC 的質量并無明顯差異。

3 討論

3.1 GFC中含有茯苓，茯苓的主要指標性成分

三萜酸類成分在制劑中的含量相對較低，由于三萜酸類成分的紫外吸收度也較差，用 HPLCUV 檢測靈敏度低，且耗時較長，難以建立有效的含量測定方法。經本實驗研究，采用UPLCMS/MS測定GFC中的三萜酸類成分，具有選擇性好的特點，且具有更高的靈敏度和專屬性，同時該方法亦具有較好的適用性，可以實現在中藥成方制劑中茯苓三萜酸類成分的含量測定。

3.2 內標化合物

銀杏內酯B為二萜類化合物，結構中有 5 個五元環，而所測成分為三萜類成分，結構中有4個環狀結構，比較二者所含有的基團及結構特征，發現二者極性相似，且在甲醇中的溶解度也相似，符合內標物的選擇原則（物理化學性質相似等原則），故選擇銀杏內酯B作為內標物。

3.3 色譜條件

UPLC比一般 HPLC具有更高的選擇性和分離度，通過不同溶劑系統（乙腈、甲醇）對 6 種三萜酸類成分分離效果影響的實驗比較。實驗發現甲醇的分離效果及色譜峰峰形較好，同時向流動相中加入甲酸能抑制三萜酸類成分色譜峰的拖尾。因三萜酸類成分含有COOH，顯弱酸性，加入適量甲酸可以改善峰形，調節分離度，結果表明甲醇0.1%甲酸溶劑系統為 GFC中茯苓三萜酸類成分分析的適用溶劑系統。

3.4 質譜條件

本實驗用 UPLCMS/MS對三萜酸類成分定量，均采用MRM模式。將6種三萜酸及銀杏內酯B分別由針泵進樣，直接進入ESI 源進行質譜分析，分別在正負離子模式下檢測，待測物在負離子模式下更穩定、靈敏度更高；在負離子模式下檢測，同時獲取母離子、子離子信息，并選擇適宜的子離子探索最佳的CE，DP，EP，CXP。與紫外檢測器相比，MRM 技術不需要待測物在色譜柱中完全分離，也不需要物質具有紫外吸收也可以得到相關質譜信息與數據，并有效的進行定性定量分析，增加了定量的準確度。

3.5 三萜酸質譜裂解分析

根據質譜裂解規律，茯苓酸[12]的最佳離子對為m/z 527.8→465.5，裂解的子離子m/z 465.5 為分子離子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2產生的[M-H-H2O-CO2]峰。去氫茯苓酸[13]的最佳離子對為m/z 525.6→465.6，裂解的子離子m/z 465.6 為分子離子峰失去1分子 CH3COOH 產生的[M-H-CH3COOH]峰。去氫土莫酸[13]的最佳離子對為m/z 483.4→337.3，裂解的子離子m/z 337.3 為分子離子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2，以及 C24雙鍵麥氏重排后的產物。去氫齒孔酸[13]最佳離子對為m/z 467.4→337.1，裂解的子離子m/z 337.4 為分子離子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2，以及 C24雙鍵斷裂后的產物。松苓新酸[13]最佳離子對為m/z 453.4→337.0，裂解的子離子m/z 337.0 為分子離子峰失去2分子 CH4以及 C24雙鍵麥氏重排后的產物。豬苓酸C[13]最佳離子對為m/z 481.5→419.5，裂解的子離子m/z 419.5 為分子離子峰失去1分子 H2O 和1分子 CO2產生的 [M-H-H2O-CO2] 峰。以上的質譜裂解特征，是 UPLCMS/MS定量分析識別檢測成分的信號特征，構成采用 UPLCMS/MS檢測三萜酸類成分的理論基礎。endprint

3.6 供試品制備方法

對制劑樣品前處理過程中，以甲醇、95%乙醇、乙酸乙酯為提取溶劑，采用超聲提取與回流提取法，同時考察提取次數以及時間對實驗結果的影響。結果表明乙酸乙酯作為提取溶劑時各成分含量最高，95%乙醇次之，甲醇最小，原因可能是三萜酸類成分極性較小，用乙酸乙酯提取，由于相似相溶作用，成分提取的更完全，而甲醇、95%乙醇極性較大，未能完全提取出三萜酸類成分，最終確定供試液最佳提取條件為：乙酸乙酯為提取溶劑，超聲提取1次，提取1 h。

3.7 建立含量測定方法

本實驗通過對質譜條件和色譜條件的優化，建立了適合的三萜酸類成分含量測定方法。通過對7個批次的 GFC 進行分析測定，結果表明GFC批間質量一致性較好。UPLCMS/MS同時測定GFC中6種三萜酸類成分的測定方法快速、準確，與傳統采用HPLCUV測定的方法相比，能同時測定不同類型的三萜酸類成分，而且樣品分析時間大大縮短，能從1 h縮短至15 min；該方法具有分離度高，峰形好的特點，對GFC中茯苓三萜酸類成分的含量測定，可為 GFC的質量控制提供參考方法，由于該方法具有一定的適用性，也可為含茯苓的中藥成方制劑中建立含量測定方法提供參考。

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[責任編輯 孔晶晶]endprint