王棗子總黃酮影響佐劑性關節炎大鼠病理的分子機制研究

繆成貴 時維靜 魏偉　秦梅頌　陳浩 張兵

[摘要] 課題組前期研究發現宿州地方特色藥材王棗子中總黃酮（total flavonoids of Isodon amethystoides，TFIA）對佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）具有一定的治療作用，并且這種治療作用可能是通過對miR152表達的上調實現的，該文進一步研究TFIA對AA大鼠病理機制影響的分子機制。采用完全弗氏佐劑制備AA大鼠，TFIA灌胃治療，采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對AA大鼠關節滑膜成纖維樣滑膜細胞（fibroblast like synoviocytes，FLS）中miR152、甲基化酶DNMT1及甲基化結合蛋白MeCP2構成的負調控環路的影響，對miR152下游經典Wnt信號通路的影響，對AA大鼠病理基因fibronectin表達的影響。TFIA灌胃治療顯著抑制DNMT1表達，逆轉了AA大鼠病理中存在的由miR152，DNMT1和MeCP2構成的負調控環路，向治療組FLS轉染miR152 inhibitors后，DNMT1表達顯著恢復。TFIA灌胃治療顯著上調SFRP4表達，抑制經典Wnt信號通路關鍵基因βcatenin，Cmyc和ccnd1表達，顯著抑制AA病理基因fibronectin表達，向治療組FLS轉染miR152 inhibitors后，逆轉了TFIA灌胃治療對SFRP4，βcatenin，Cmyc，ccnd1和fibronectin表達的影響。TFIA可能通過miR152表達的上調抑制DNMT1表達，上調SFRP4表達，抑制經典Wnt信號關節基因βcatenin，Cmyc，ccnd1表達，抑制RA基因fibronectin表達。

[關鍵詞] 王棗子總黃酮； 佐劑性性關節炎； miR152； 成纖維樣滑膜細胞； 經典Wnt信號通路

Molecular mechanism of total flavonoids in Isodon amethystoides

on adjuvant arthritis in rats

MIAO Chenggui1*， SHI Weijing1， WEI Wei1， QIN Meisong1， CHEN Hao1， ZHANG Bing2

（1. Food and Drug College， Anhui Science and Technology University， Fengyang 233100， China；

2. The First Affiliated Hospital， Anhui Medical University， Heifei 230032， China）

[Abstract] Our preliminary study showed that the total flavonoids in Isodon amethystoides（TFIA）， a local medicinal herb in Suzhou， had a certain therapeutic effect on adjuvant arthritis， and this therapeutic effect may be achieved through the upregulation of miR152 expression. In this paper， the molecular mechanism of TFIA on the pathogenesis of adjuvant arthritis（AA） rats was further studied. AA rats were prepared with complete Freund′s adjuvant， and then treated with TFIA by intragastric administration. Realtime qPCR was used to detect the effects of TFIA on the negative regulatory loop of miR152， methylase DNMT1 and methylCpG binding protein MeCP2 in fibroblast like synoviocytes（FLS） of AA rats， as well as the effects of TFIA on the classic Wnt signaling pathway and the expression of fibronectin gene in AA rats. Intragastric administration of TFIA significantly inhibited the expression of DNMT1 and reversed the negative regulatory loop composed of miR152， DNMT1 and MeCP2 in the pathology of AA rats. After transfection of miR152 inhibitors into the FLS in treatment group， DNMT1 expression was significantly restored. TFIA significantly upregulated the expression of SFRP4 and inhibited the expression of βcatenin， Cmyc and ccnd1， the key genes of canonical Wnt signaling pathway. TFIA also significantly inhibited the expression of fibronectin， an AA gene. The effect of TFIA on the expression of SFRP4， βcatenin， Cmyc， ccnd1 and fibronectin was reversed after transfection with miR152 inhibitors in the treatment group FLS. TFIA may inhibit the DNMT1 expression， upregulate the SFRP4 expression， inhibit the expression of classical Wnt signaling genes βcatenin， Cmyc， and ccnd1 as well as the RA gene fibronectin expression through the upregulation of miR152 expression.endprint

[Key words] total flavonoids of Isodon amethystoides； adjuvant arthritis； miR152； fibroblast like synoviocytes； canonical Wnt signal pathway

王棗子Isodon amethystoides為香茶菜屬草本植物，是安徽省宿州市埇橋區當地常用的地方特色中藥材，實踐證明王棗子具有較好的抗炎解毒、醒酒保健等功效[12]。黃酮類成分是中草藥中常見的含量較高的藥效成分，課題組研究表明王棗子莖葉中含有豐富的黃酮類物質，并且王棗子中總黃酮（total flavonoids of I. amethystoides，TFIA）對RA模型大鼠佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠具有一定的治療作用。

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性的、自身免疫性疾病，主要發病部位是人手足等小關節部位，病理變化主要包括成纖維樣滑膜細胞（fibroblast like synoviocytes，FLS）異常增殖、關節軟骨侵蝕、軟骨不可逆的損害、關節變形等，嚴重的可影響關節功能，甚至造成終身殘廢[3]?，F有的研究表明，FLS異常增殖在RA發病機制中扮演了關鍵角色[4]。AA大鼠病理特點與RA極為相似，是常用的RA病理和治療研究的模型動物[5]，本課題組亦采用AA大鼠作為RA研究的模型動物探討RA的病理機制。通過對AA大鼠病理機制的研究，課題組發現與對照相比，AA大鼠關節滑膜中miR152表達顯著降低，同時DNMT1和MeCP2表達顯著升高。AA大鼠病理中存在著miR152過表達抑制DNMT1表達，高表達的DNMT1和MeCP2協同抑制miR152表達的雙向負調控環路。過表達的miR152通過抑制DNMT1表達抑制經典Wnt信號通路活性，進而抑制AA大鼠病理發展[67]。

RA發病年齡有年輕化的趨勢，RA病因仍然未能完全闡明[8]，積極探討中藥在RA病理中的作用及分子機制對RA的預防和治療有重要的積極意義。課題組前期研究結果顯示，經TFIA灌胃治療后，TFIA灌胃治療能顯著抑制AA大鼠足爪腫脹度，顯著抑制IL1表達，顯著抑制AA大鼠FLS增殖活力。與對照組相比，AA組FLS中miR152表達顯著降低，過表達的miR152顯著抑制IL1表達，抑制FLS增殖。TFIA對AA大鼠足爪腫脹具有一定的抑制作用，并且這種抑制作用可能是通過miR152表達的調控實現的。本文課題組以AA大鼠為研究模型，采用Realtime qPCR等方法檢測TFIA灌胃治療對AA大鼠FLS中miR152，DNMT1及MeCP2構成的負調控環路的影響，對miR152下游經典Wnt信號通路的影響，對AA大鼠病理基因fibronectin表達的影響，探討TFIA治療RA的分子機制。

1 材料

TFIA：取王棗子干燥莖葉，充分烘干并粉碎。使用95%乙醇提取并減壓濃縮，濃縮物再用水溶解，然后調pH至2.0，最后乙醚萃取，得到的有機相精制濃縮備用。經測定TFIA質量分數>85%；逆轉錄試劑盒（美國Fermentas）；miR152引物（德國Qiagen）；miR152 inhibitors及NSmiRNA（上海吉瑪）；QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒（德國Qiagen公司）；脂質體LipofectamineTM 2000，OptiMEM（美國Invitrogen公司）；新生胎牛血清（美國Hyclone）。

2 方法

2.1 AA大鼠制備 雄性SD大鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心（皖醫實動準字第01號），體質量160～180 g，適用性飼養4 d后隨機分組，即空白對照組、AA組、TFIA 100 mg·kg-1給藥治療組、給藥陰性對照組、轉染組、轉染陰性對照組等，每組大鼠10只?？瞻讓φ战M采用足跖底部注射方法注射0.1 mL生理鹽水，其余各組足跖底部注射完全弗氏佐劑0.1 mL制備AA大鼠。

2.2 AA大鼠關節炎評分 采用常規的大鼠關節炎評分方法評價AA大鼠是否制備成功。具體如下：大鼠鼻子出現紅腫或結節評為1分，尾巴出現紅腫或結節評為1分，1只耳朵出現紅腫或結節評為1分，1只足爪出現癥狀評為1分。每只大鼠最高得分8分。

2.3 大鼠滑膜FLS原代培養 采用組織塊方法培養FLS。SD大鼠注射完全弗氏佐劑后第4天給藥治療，第28天處死動物，無菌條件下分離大鼠膝關節滑膜組織，小剪刀剪碎成1～3 cm3大小滑膜組織塊。長玻璃吸管轉移組織塊進入無菌一次性細胞培養瓶內，貼壁擺放整齊，每瓶細胞加入3 mL含胎牛血清的DMEM細胞培養基，置細胞培養箱內反扣培養7 h，使細胞貼壁緊密，然后反正培養6 d，每隔3 d更換1次細胞培養基。然后棄凈瓶內培養基，每瓶細胞加胰酶0.5 mL消化細胞0.5 min，使用移液器充分吹打貼壁細胞制備細胞懸液，按1∶2比例傳達培養，本試驗所用細胞為傳代3～5代FLS。

2.4 miR152 inhibitors細胞轉染 在FLS傳代3～5代內，待FLS鋪滿細胞培養瓶瓶壁90%以上，細胞長勢良好時，棄凈瓶內培養基，加生理鹽水3 mL洗滌2次，然后加胰酶0.5 mL消化細胞0.5 min。使用移液器無菌條件下充分吹打制備1×105 個/mL的FLS懸液，接種FLS于6孔板內，細胞密度適中，然后置細胞培養箱內5% CO2，37 ℃條件培養至FLS鋪滿細胞培養瓶瓶壁75%左右用于細胞轉染。采用lipofetaminTM 2000轉染試劑向各組FLS轉染miR152 inhibitors及陰性對照序列NSmiRNA，轉染步驟參照轉染試劑盒提供的方法。

2.5 Realtime qPCR檢測 Trizol試劑常規提取各試驗組FLS的總RNA，參照Fermentas試劑盒提供的逆轉錄步驟逆轉錄各組試驗大鼠FLS的cDNA。Realtime qPCR引物購自德國Qiagen公司，參照Qiagen公司試劑盒提供的定量擴增步驟，采用Realtime qPCR方法檢測各靶基因在不同樣本中的表達。擴增條件為95 ℃ 15 min，然后94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共擴增40個循環。endprint

2.6 統計學分析 數據分析采用SPSS 17.0軟件，所有數據結果均以±s表示，組間比較采用OneWay ANOVA檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 TFIA灌胃治療對DNMT1表達的影響 課題組前期研究發現，與對照相比，AA大鼠關節滑膜中miR152表達顯著降低，DNA甲基化酶DNMT1和甲基化結合蛋白MeCP2表達顯著升高，過表達的miR152抑制DNMT1表達，并且過表達的DNMT1和MeCP2反過來能協同抑制miR152表達，過表達的miR152通過抑制DNMT1表達抑制經典Wnt信號通路活性，進而抑制AA大鼠病理發展。同時，課題組前期研究發現TFIA灌胃治療能夠顯著恢復AA大鼠滑膜中miR152的表達，鑒于miR152與DNMT1，MeCP2之間的相互調控關系，TFIA灌胃治療是否會對DNA甲基化酶DNMT1的表達產生影響？課題組分離各試驗組AA大鼠滑膜組織，培養FLS，采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對DNMT1表達的影響。結果顯示TFIA灌胃治療后，與AA大鼠組相比，治療組的DNMT1表達均值由1.508 1降低至1.309 2，顯著降低。向治療組AA大鼠FLS轉染miR152 inhibitors后，DNMT1表達均值由1升高至1.208 6，又顯著升高，提示TFIA通過對miR152表達上調抑制了DNMT1表達，見圖1。

3.2 TFIA灌胃治療對經典Wnt信號通路上游負調控因子SFRP4表達的影響 SFRP4是經典Wnt信號通路上游負調控因子，課題組前期研究發現SFRP4在AA發病過程中發生了甲基化修飾致使其表達顯著降低。課題組采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對SFRP4表達的影響，結果發現，與AA組相比，治療組FLS中SFRP4表達均值由0.710 8升高至0.838 2，顯著升高。向治療組AA大鼠FLS轉染miR152 inhibitors后，SFRP4表達由1降低至0.881 4，又顯著降低，提示TFIA可能通過對miR152，DNMT1表達的調控影響了SFRP4表達，見圖2。

3.3 TFIA灌胃治療對經典Wnt信號通路表達的影響 課題組前期研究發現經典Wnt信號通路在AA發病過程被激活了，及信號通路關鍵基因βcatenin，Cmyc，ccnd1表達都顯著上調。課題組采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對經典Wnt信號通路的影響，結果發現，與對照相比，TFIA灌胃治療后經典Wnt信號通路活性降低，即βcatenin表達均值由1.907 2降低至1.710 9，Cmyc表達均值由1.415 5降低至1.200，8，ccnd1表達均值由1.682 2降低至1.308 5，都顯著被抑制。向治療組AA大鼠FLS轉染miR152 inhibitors后，βcatenin表達均值由1升高至1.150 7，Cmyc表達均值由1升高至1.161 3，ccnd1表達均值由1升高至1.090 6，都顯著升高了。結合前期研究結果，TFIA可能是通過對miR152，DNMT1表達的調控影響了經典Wnt信號通路活性，見圖3。

3.4 TFIA灌胃治療對AA病理基因fibronectin表達的影響 fibronectin是AA大鼠及RA疾病發生的標志性基因，課題組前期研究發現AA病理基因fibronectin在AA發病過程顯著高表達。課題組采用Realtime qPCR檢測TFIA灌胃治療對fibronectin表達的影響，結果發現，與AA組相比，治療組fibronectin均值由1.507 3降低至1.310 9，顯著降低。向治療組AA大鼠FLS轉染miR152 inhibitors后，fibronectin由1上調至1.106 6，顯著升高，見圖4。提示TFIA影響了AA大鼠的發病機制，并且這種影響是通過對miR152，DNMT1及經典Wnt信號通路的影響實現的。

4 討論

王棗子主要用于治療清熱解毒、腹瀉等，具有較好的抗菌消炎、調節免疫力等作用，為宿州市埇橋區當地群眾廣泛使用的地方特色藥材。經鑒定，王棗子屬于唇形科香茶菜屬草本植物，并且在安徽、江蘇、湖北等地都有分布?，F代藥理研究王棗子中齊墩果酸含量豐富，并且有降血糖、降血脂、強心、抗心律失常等功效[910]。鑒于草本植物中含有豐富的黃酮類成分[11]，本課題組從王棗子中總黃酮作為切入點，研究王棗子總黃酮TFIA對RA的作用。前期研究顯示TFIA具有一定的治療RA模型動物AA大鼠的作用，并且這種治療作用可能是通過對AA大鼠滑膜細胞FLS中miR152表達的調控實現的。本文采用完全弗氏佐劑制備AA大鼠，組織塊方法培養FLS，研究TFIA通過對miR152的調控對miR152下游其他靶基因及相關的信號通路，特別是經典Wnt信號通路的影響，探討TFIA治療AA的分子機制。

本課題組前期研究發現，在AA大鼠病理機制中存在著低表達的miR152受DNA甲基化酶DNMT1和甲基化結合蛋白MeCP2共同抑制，過表達的miR152能夠抑制DNMT1表達的雙向負調控環路，并且過表達的miR152通過對DNMT1的抑制上調經典Wnt信號通路上游負調控因子SFRP4表達，進而抑制經典Wnt信號通路的開放、抑制AA病理基因fibronectin的表達[68]。

本課題組前期發現TFIA灌胃治療AA大鼠后恢復了miR152的表達，因此本課題組預測TFIA可以通過對miR152表達的上調影響DNMT1、經典Wnt信號及fibronectin的表達。本文采用細胞培養、Realtime qPCR等研究方法研究TFIA通過對miR152的調控對miR152下游其他靶基因及相關的信號通路，結果發現，AA大鼠灌胃治療顯著抑制DNA甲基化酶DNMT1表達，逆轉了AA大鼠病理中存在的由miR152和DNMT1和MeCP2構成的負調控環路。向治療組FLS轉染miR152 inhibitors后，DNMT1表達顯著恢復，即TFIA通過對miR152的上調達到抑制DNMT1的作用。AA大鼠灌胃治療顯著上調SFRP4表達，抑制經典Wnt信號通路關鍵基因βcatenin，Cmyc和ccnd1的表達，顯著抑制AA病理基因fibronectin的表達。向治療組FLS轉染miR152 inhibitors后，逆轉了灌胃治療對SFRP4和fibronectin的表達，逆轉了對經典Wnt信號通路的影響。本文研究結果提示TFIA灌胃起到的治療AA作用可能是通過對miR152，DNMT1及MeCP2構成的負調控環路及經典Wnt信號通路的影響實現的。endprint

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[責任編輯 張寧寧]endprint