納米鈀用于抗腫瘤的研究

姚依蘭，馮 閣，黃鳳華，舒 暢，張西鋒

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

納米鈀用于抗腫瘤的研究

姚依蘭，馮 閣，黃鳳華，舒 暢，張西鋒

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

以本實驗室合成的納米鈀(PdNPs)為研究對象，以子宮頸癌細胞Hela細胞為模型，檢測納米鈀的抗腫瘤活性。結果表明：HeLa細胞經納米鈀處理后，細胞增殖顯著被抑制，細胞內乳酸脫氫酶(LDH)和活化氧(ROS)水平顯著上升，PdNPs降低了HeLa細胞組蛋白去乙?；?HDAC)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性，促進了細胞的凋亡。此為癌癥的治療提供一個新的治療方法。

納米鈀；抗腫瘤；活化氧；凋亡

Abstract：The effects of nano-palladium (PdNPs),synthesised by our lab, were studied in this study. Using Hela cells as a model,the anti-tumor activity of PdNPs was checked. The results show that the cell viability was significantly inhibited after PdNPs treated, the levels of Lactate dehydrogenase(LDH) and reactive oxygen species(ROS) in the treated cells were significantly increased,and PdNPs reduced the activity of histone deacetylase (HDAC), glutathione (GSH), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) in HeLa cell, eventually leading to cell apoptosis. Which is a new treatment for the treatment of cancer.

Key words：palladium nanoparticle; antitumor; reactive oxygen species(ROS);apoptosis

1 引言

一類新的材料逐漸被人們熟知，那就是納米材料(nanomaterial)。它是納米級結構材料的簡稱，指在三維空間中的材料其至少有一維是納米級別，尺寸在0.1―100 nm。納米材料特殊的構成方式，與其他物質相比具有更大的比表面積，這樣就賦予了它一些獨特的效應，分別是體積效應、表面效應、量子尺寸效應和宏觀量子隧道效應。納米材料的化學性能、催化性能、光學性能、電磁性能、力學性能都有其獨特之處，進而使納米材料的研究與應用得到了迅速的發展[1-2]。醫學中，利用納米材料良好的生物相容性、透過性和吸附性，可以將納米材料作為載體，負載藥物，制成緩釋劑和靶向制劑[3]。研究者們發現納米材料對腫瘤細胞活性有不同程度的抑制作用，這引起了廣泛的關注，可為腫瘤治療提供新的治療方法。

金屬納米顆粒以其特異的特性，已用于抗腫瘤的治療與研究[4-5]。PdNPs已被用作抗菌劑，抗真菌劑和抗癌劑，但它們在癌癥研究中的作用仍然難以捉摸。本研究以本實驗室合成的納米鈀(PdNPs)為研究對象，以子宮頸癌細胞Hela細胞為模型，檢測納米鈀的抗腫瘤活性。為PdNPs用于癌癥的研究和治療提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

納米鈀為本實驗室合成；細胞培養相關試劑購自Sigma公司，其它所用試劑均為國產分析純試劑；MTT、LDH、ROS和HDAC檢測試劑盒購自Beyotime公司，氧化應激標記物檢測試劑盒購自艾美捷科技公司。

2.2 儀器與設備

熒光倒置顯微鏡及顯微圖像分析系統 Nikon TE2000U；CO2培養箱 Thermo。

2.3 方法

氧化應激標記物和組蛋白去乙?；傅臋z測方法參考試劑盒的說明書進行。細胞的培養、噻唑藍(MTT)檢測、活化氧(ROS)檢測和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)檢測等方法[6]。

3 結果與分析

3.1 PdNPs抑制Hela細胞的活性

以宮頸癌Hela細胞來評估PdNPs的抗腫瘤活性。用不同濃度的PdNPs處理細胞24 h，然后用WST-8法來檢測細胞活力。如圖1所示，PdNPs對Hela細胞生長具有抑制作用，PdNPs對于HeLa細胞的50%抑制濃度為125 nM。

圖1 HeLa細胞經過不同濃度PdNPs處理后細胞活性

3.2 PdNPs抑制組蛋白去乙?；?HDAC)的活性

在空白組的基礎上，設置50 nM的PdNPs處理組。結果如圖2所示，與對照組相比50 nM的PdNPs在一定程度上降低了HDAC的活性。

圖2 PdNPs對Hela細胞HDAC活性的影響

3.3 PdNPs的細胞毒性

當細胞膜被破壞時，細胞內的乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)就會被釋放到細胞外，LDH的泄漏量是評估細胞毒性的重要標準，因此我們通過LDH法來評估組合藥物的細胞毒性。測量對照組和處理組細胞外的LDH含量。如圖3A所示，PdNPs處理組與對照組相比LDH的泄漏量有所提高。

利用熒光探針DCFH-DA來檢測細胞中活性氧的水平，DCFH-DA本身沒有熒光，當它自由穿過細胞膜，進入活細胞后，被細胞內的酯酶水解生成DCFH。DCFH不能通透細胞膜，從而探針被固定在細胞內，無熒光的DCFH被細胞內的活性氧氧化生成有熒光的DCF，從而檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。如圖3B所示，PdNPs處理組與對照組相比， DCF的熒光強度增高，ROS有所提高。

3.4 PdNPs對氧化應激標記物的影響

通過保持細胞中ROS的水平來殺死癌細胞，進而達到治療的目的，確實是一種有效的方法，但是細胞中ROS的水平取決于ROS的產生和消除這兩個方面。Oberley 等人認為在惡性細胞和原發性癌組織中ROS清除酶的水平會有顯著的改變。因此我們研究PdNPs會不會影響HeLa細胞中相關標記物的水平，比如丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)。從實驗結果(圖4)可知，PdNPs處理組中的MDA含

圖3 PdNPs對Hela細胞的細胞毒性

量達到了1.5 nmol/mg蛋白。HeLa細胞處理后GSH、SOD和CAT的水平，它們的含量是細胞中的GSH、SOD和CAT的水平是細胞抗氧化能力一個非常重要的指標[7]。細胞內GSH的水平會影響抗癌藥物誘導癌細胞凋亡的效果[8]。與對照組相比，處理組的GSH、SOD和CAT的水平都明顯降低，這和前面的實驗結果是一致的，PdNPs會升高HeLa細胞中ROS的水平，降低GSH的水平。

圖4 PdNPs對Hela細胞氧化應激標記物的影響

3.5 PdNPs促進細胞凋亡

JC-1是一種理想的檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)的熒光探針，它用途廣泛，可以檢測純化的線粒體、細胞和組織的膜電位，MMP下降意味著細胞出現凋亡。細胞在MMP較高時，JC-1會形成聚合物(J-aggregates) 發出紅色熒光并且聚集在線粒體的基質(matrix)中；在MMP降低后，JC-1為單體(monomer)，不能聚集在線粒體的基質中，發出綠色熒光，我們通過熒光顏色的變化來檢測MMP的變化，并且紅綠熒光的相對比例會顯示線粒體去極化的水平。HeLa細胞經過PdNPs處理24 h后，加入JC-1來測定MMP。由圖5A可以看到與對照組相比，處理組的紅/綠熒光強度比有所下降，說明處理組細胞MMP去極化嚴重。

Caspase-3的激活會誘導DNA的斷裂，這是細胞凋亡的一個生化學特征。我們通過TUNEL試劑盒來檢測經過處理后的HeLa細胞的凋亡情況。由圖5B可知，凋亡的HeLa細胞被標記在圖中顯示成亮白點，與對照組相比，PdNPs處理組的細胞凋亡更為顯著。

圖5 PdNPs對Hela細胞凋亡的影響

4 結論

通過WST-8來研究PdNPs對癌細胞活性的影響，發現PdNPs對細胞的毒性都有濃度依賴性。對于HeLa細胞，PdNPs的50%抑制濃度為125 nM。

納米鈀顆粒(PdNPs)的異質性具有催化性能、高的表面積與體積比和高的表面能[9]。含有砜的聚酰胺的PdNPs配合物有一個獨特性質就是高抗菌效力[10]。與單獨使用化療和光熱治療相比，加入PdNPs后，PdNPs會顯示出協同作用并提高療效[11]。有研究表明，PdNPs對五種不同的人癌細胞系都有高細胞毒性[12]。另外，PdNP的細胞毒性和誘導凋亡是有濃度依賴性的，并且和許多細胞因子的表達有關[13]。在誘導人卵巢的凋亡和自噬，PdNPs也是有濃度依賴性的[14]。 大量的研究報告了通過化學方法合成PdNPs，然而，用生物分子介導PdNPs的合成和PdNPs的細胞毒性機制并不是很明確。因此，合成具有生物相容性、無毒、環保的PdNPs是必不可少的，生物相容性的PdNP對于癌癥研究和治療也會有積極意義?；熢诎┌Y治療中得到了廣泛的應用，但是治療效果卻因為腫瘤異質性和腫瘤耐藥性的產生而大打折扣，但如果使用組合療法，可能同時抑制多個目標或信號通路，這就顯得至關重要[15]。例如，血管內皮生長因子(VEGFR)抗體DC101和長春堿組合使用，在異種神經母細胞瘤模型中會出現持續的腫瘤消退[16]。

通過保持ROS在一個高水平，進而可以有效地殺死癌細胞。此不僅關系到ROS的產生，也關系到ROS的消除。由我們的研究結果可以知道，PdNPs可以降低細胞消除ROS的能力，這樣從另一方面提升了細胞中ROS的水平。Huang 等人研究了SOD是如何作為被殺死的癌細胞的標記。SOD水平的降低會使細胞中活性氧的水平升高，這樣會導致線粒體介導的細胞凋亡[17]。

[1] Zhang H, Zheng D, Ding J, et al. Efficient delivery of ursolic acid by poly (N-vinylpyrrolidone)-block-poly (ε-caprolactone) nanoparticles for inhibiting the growth of hepatocellular carcinoma in vitro and in vivo[J]. Int J Nanomedicine ,2015,10:1909-1920.

[2] Kruefu V, Wisitsoraat A, Tuantranont A, et al.Gas sensing properties of conducting polymer/Au-loaded ZnO nanoparticle composite materials at room temperature[J]. Nanoscale Res Lett, 2014, 9(1):467.

[3] Fang W, Tang S, Liu P, et al. Pd nanosheet-covered hollow mesoporous silica nanoparticles as a platform for the chemo-photothermal treatment of cancer cells[J]. Small, 2012, 8(24):3816.

[4] Perillo E, Hervé-Aubert K, Allard-Vannier E, et al. Synthesis and in vitro evaluation of fluorescent and magnetic nanoparticles functionalized with a cell penetrating peptide for cancer theranosis[J]. Colloid Interface Sci,2017,499(29):209-217.

[5] Labala S, Jose A, Chawla S, et al. Effective melanoma cancer suppression by iontophoretic co-delivery of STAT3 siRNA and imatinib using gold nanoparticles[J].Int Pharm. 2017, S0378-5173(17):30273-30279.

[6] Zhang X F, Choi Y J, Han J W. Differential nanoreprotoxicity of silver nanoparticles in male somatic cells and spermatogonial stem cells[J]. Int Nanomed, 2015,10: 1335-1357.

[7] Dr?ge W. Free radicals in the physiological control of cell function[J]. Physiological Reviews, 2002, 82(1):47-95.

[8] Fath M A, Ahmad I M, Smith C J, et al. Enhancement of carboplatin-mediated lung cancer cell killing by simultaneous disruption of glutathione and thioredoxin metabolism[J]. Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research, 2011, 17(19):6206-17.

[9] Narayanan R, Elsayed M A. FTIR study of the mode of binding of the reactants on the Pd nanoparticle surface during the catalysis of the Suzuki reaction[J]. The journal of physical chemistry. 2005, 109(10):4357.

[10] Elhusseiny A F, Hassan H H. Antimicrobial and antitumor activity of platinum and palladium complexes of novel spherical aramides nanoparticles containing flexibilizing linkages: structure-property relationship[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy, 2013, 103(103C):232-245.

[11] Fang W, Tang S, Liu P, et al. Pd nanosheet-covered hollow mesoporous silica nanoparticles as a platform for the chemo-photothermal treatment of cancer cells[J]. Small, 2012, 8(24):3816.

[12] Balbin A, Gaballo F, Ceballostorres J, et al. Dual application of Pd nanoparticles supported on mesoporous silica SBA-15 and MSU-2: supported catalysts for C-C coupling reactions and cytotoxic agents against human cancer cell lines[J]. Rsc Advances, 2014, 4(97):54775-54787.

[13] Boscolo P, Bellante V, Leopold K, et al. Effects of palladium nanoparticles on the cytokine release from peripheral blood mononuclear cells of non-atopic women[J]. Journal of Biological Regulators & Homeostatic Agents, 2010, 24(2):207.

[14] Gurunathan S, Kim E, Han JW, et al. Green Chemistry Approach for Synthesis of Effective Anticancer Palladium Nanoparticles[J]. Molecules, 2015, 20(12):22476.

[15] Li F, Zhao C, Wang L. Molecular-targeted agents combination therapy for cancer: developments and potentials[J].International Journal of Cancer Journal International Du Cancer, 2014, 134(6):1257-69.

[16] Klement G, Baruchel S, Rak J, et al. Continuous low-dose therapy with vinblastine and VEGF receptor-2 antibody induces sustained tumor regression without overt toxicity[J]. Journal of Clinical Investigation, 2000, 105(8):15-24.

[17] Huang P, Feng L, Oldham E A, et al. Superoxide dismutase as a target for the selective killing of cancercells[J]. Nature, 2000, 407(6802):390-395.

Research on Anti-cancer of palladium nanoparticles

YAOYi-lan，FENGGe，HUANGFeng-hua，SHUChang,ZHANGXi-feng

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

2017-04-17.

姚依蘭(1993-)，女，碩士研究生，E-mail:1425888756@qq.com.

張西鋒(1977-)，男，博士，副教授，E-mail:zhangxf9465@163.com.

國家自然科學基金(B020704).

2095-7386(2017)03-0037-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.03.007

Q 819

A