茶多酚EGCG抑制大腸桿菌O157:H7生物膜研究

肖 潔，張秀琴，杜文芳，段合波，李 睿

(1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.神農架林區檢驗檢測中心，湖北 神農架 442400)

茶多酚EGCG抑制大腸桿菌O157:H7生物膜研究

肖 潔1，張秀琴2，杜文芳1，段合波1，李 睿1

(1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2.神農架林區檢驗檢測中心，湖北 神農架 442400)

研究低于抑菌濃度的茶多酚EGCG對大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜形成和泳動性能的影響。在培養基中添加不同濃度的EGCG加入到玻璃試管，接種大腸桿菌O157:H7 EDL933，30 ℃下靜置培養5 d。結晶紫法測定生物膜量。結果表明亞抑菌濃度(0.125 mg/mL，0.25 mg/mL，0.5 mg/mL)的EGCG可以顯著抑制大腸桿菌O157:H7 EDL933的生物膜形成。0.3% LB軟瓊脂加入亞抑菌濃度(0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL)的EGCG，37 ℃培養大腸桿菌O157:H7 EDL933 24 h,結果證實大腸桿菌O157:H7 EDL933泳動能力顯著減小。結果證實EGCG具有很強的抑制細菌生物膜的能力，有望用于食品工業控制細菌污染。

茶多酚EGCG; 大腸桿菌O157:H7;生物膜;泳動性

Abstract：The effects of Epigallocatechin gallate (EGCG) on the biofilm formation and swimming motility ofEscherichiacoliO157:H7 were studied. The mediums supplemented with different concentrations of EGCG were added into glass tubes, thenEscherichiacoliO157:H7 EDL933 was innoculated and statically incubated at 30℃ for 5days. Biofilm biomass was measured by crystal violet assay. The results indicated that sub-MIC (0.125mg/mL,0.25mg/mL and 0.5mg/mL) of EGCG significantly inhibited the biofilm formation byEscherichiacoliO157:H7. Soft LB agar (0.3%) containing EGCG (0.125mg/mL,0.25mg/mL and 0.5mg/mL) was used in swimming inhibitory assay. The results showed that EGCG significantly suppressed swimming motility ofEscherichiacoliO157:H7 at 37℃. These results suggested the feasibility of using EGCG in food industry to controlEscherichiacoliO157:H7 growth and biofilm formation.

Key words：Epigallocatechin gallate;EscherichiacoliO157:H7; biofilm; swimming motility

1 引言

腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhageEscherichiacoli，EHEC)是一類重要的食源性致病菌，可嚴重威脅人類健康。EHEC具有多種血清型，大腸桿菌O157:H7是其中最典型的一種血清型，其發病率最高、致病性最強、流行性最廣[1]。

細菌生物膜是指細菌為了適應外界環境附著于其他表面上，分泌胞外多糖、脂蛋白等胞外聚合物，通過細胞彼此粘附并被自身產生的胞外聚合物包圍形成的大量膜樣物質[2]。生物膜形成的三要素為：細菌、細菌附著的表面及胞外基質[2]。細菌生物膜被認為是細菌為適應不利生存條件而產生的，生物膜中的細胞通常比浮游狀態的細胞具有更頑強的生命力，對不利的生存環境(例如干燥失水、極端溫度、抗生素、消毒劑等)的適應能力增強[3]。生物膜促使細菌對抗生素產生耐藥性[3]?，F有研究表明，細菌生物膜形成除受到環境因素包括溫度、PH值、滲透壓、離子濃度等的影響外，也與細菌自身的運動性密切相關[4]。細菌的運動性包括群集運動(Swarm motility)和浮泳運動(Swim motility)兩種方式[4]。

茶多酚是茶葉提取物中多酚類物質的總稱。研究表明茶多酚具有抗菌、抗病毒、抗過敏、抗炎、抗癌、抗氧化等多種活性作用[5]。茶多酚對單增李斯特菌、大腸桿菌O157:H7、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等多種致病菌的生長具有明顯的抑制作用[6]。在茶多酚中，發揮抑菌活性的主要有以下4種兒茶素：表沒食子兒茶素沒食子酸酯(E-epigallocatechin-3-gallate，EGCG)，表兒茶素(E-epicatechin，EC)，表兒茶素沒食子酸酯(E-epicatechin-3-gallate，ECG)和表沒食子兒茶素(E-epigallocatechin，EGC)[7]。EGCG在所有兒茶素中含量最高，約占其總含量的50-80%，抗菌活性最強[8]，其分子結構如圖1所示。

圖1 EGCG的分子結構

目前有很多化學類食品添加劑應用于食品保鮮中，這些添加劑都有比較好的抑菌效果，但是化學類食品添加劑因副作用大備受爭議[9]。茶多酚等天然提取物因而受到消費者歡迎。茶多酚在食品保鮮中的應用已成為一大研究熱點[10]。但茶多酚的抑菌機理目前并未闡釋清楚。筆者以茶多酚EGCG單體為研究對象，考察其對大腸桿菌O157：H7生物膜的抑制作用，為茶多酚在食品工業中的應用提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實驗菌株

大腸桿菌O157:H7 EDL933由中國檢驗檢疫科學研究院贈送。

2.1.2 主要試劑

EGCG(99.8%)購自南京廣潤生物制品有限公司；LB、MH肉湯購自青島高科園海博生物技術有限公司； 結晶紫購自美國Amresco公司；6孔細胞培養板購自武漢華順生物技術公司。

2.2 方法

2.2.1 EGCG對大腸桿菌O157:H7EDL933 最低抑菌濃度的測定

最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC) 測定參考美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2012版[11]進行。即 接種大腸桿菌O157:H7 EDL933于MH平板上，劃線分離， 待長出單菌落。挑取3—4個單菌落接種至含5 mL MH肉湯的試管中，37℃搖床培養4h至菌液OD600為0.4左右，此時細菌濁度約0.5麥氏單位。 用MH肉湯將菌液稀釋100倍。將預先配制好的EGCG 母液用MH肉湯稀釋成設定的濃度，稀釋方法參考文獻[11]進行。向96孔板中加入對應樣品，實驗組為不同濃度的EGCG，每孔加50 μL，然后加入稀釋100倍的菌液50 μL；陽性對照為50 μL MH肉湯加50 μL稀釋菌液；陰性對照為100 μL MH肉湯(無菌液)和含相應濃度EGCG的MH肉湯(無菌液)，每個樣品做4個平行孔。加入板中的菌液終濃度約為5×105CFU/mL。將96孔板置于生化培養箱中，37 ℃靜置培養20 h。MIC終點判讀：用肉眼在96孔板中所見能完全抑制細菌生長的最低抗菌藥物濃度為最小抑菌濃度。若肉眼無法準確判斷，可將96孔板置于酶標儀下測定OD600幫助判定MIC。

2.2.2 EGCG對大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜形成的影響

接種大腸桿菌O157:H7 EDL933于LB液體培養基中，150 r/min 37 ℃搖床過夜培養，用LB液體培養基調節細菌濃度，使細菌OD600接近于1。將預先配制好的EGCG 母液用1/2 LB肉湯(2倍稀釋的LB)稀釋成設定的濃度，即0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL。將菌液分別用含不同濃度EGCG的1/2 LB肉湯培養基稀釋100倍。設定陽性和陰性對照。菌液直接用1/2 L B肉湯稀釋，不加EGCG設定為陽性對照 ； 陰性對照為無菌液的1/2 LB肉湯。將各組菌液加入到滅菌小試管中，每管加2mL菌液。將試管置于生化培養箱中，30 ℃下靜置培養5 d。培養完成后，將試管內菌液小心吸出，沿管壁緩慢加入3 mL無菌PBS輕輕潤洗試管1次，于37 ℃下風干。每管加入3 mL 0.5%結晶紫染液，于37 ℃下染色30 min。棄染色液，3 mL無菌PBS(pH7.4)洗滌3次，直到陰性對照管無過量染色。 37 ℃下風干， 取3 mL 95%乙醇過夜脫色，酶標儀測定OD595吸光度值。每一實驗組和對照組設置至少三個平行對照管，取平均值，樣品最終OD值=樣品平均OD值-陰性對照OD平均值。

2.2.3 EGCG對大腸桿菌O157:H7 EDL933泳動能力的影響

接種大腸桿菌O157:H7 EDL933于LB肉湯中培養至對數期，OD600為0.4左右。制備0.3% LB軟瓊脂，高壓蒸汽滅菌后保溫于50—60 ℃待用，防止凝固。0.3% LB軟瓊脂中加入不同濃度的EGCG，混勻，使軟瓊脂中EGCG終濃度分別為0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL。 將含不同濃度EGCG的LB軟瓊脂加入6孔細胞培養板中，每孔加入3mL，將6孔板置于超凈工作臺中4 h，待LB軟瓊脂凝固后，分別取1 μL菌液點在每個LB軟瓊脂孔中央。將6孔細胞培養板正置于生化培養箱中，37 ℃培養24 h，觀察菌落形態并拍照，同時測定細菌泳動直徑大小。

2.2.4 統計學分析

本文中所有實驗均進行3次生物學重復，實驗數據以“m±SD”來表示，使用SPSS 22.0軟件進行統計分析，采用t檢驗進行組間兩兩比較，并認為p<0.05具有統計學意義且存在顯著差異(用*表示)，p<0.01為差異極顯著(**表示)。

3 結果與分析

3.1 EGCG對大腸桿菌0157:H7 EDL933的MIC測定

根據CLSI報道的方法[11]進行一定改良，測定EGCG和檸檬酸對大腸桿菌O157:H7 EDL933的MIC。由于不同濃度的EGCG自身帶有一定顏色，顏色變化會對吸光度值帶來一定干擾，故采用自身對照法檢測其對大腸桿菌O157:H7 EDL933的MIC。隨著EGCG濃度增大，EGCG本身的吸光度值增大。加入菌液培養20 h后，排除EGCG本身吸光值的干擾(表1)，可看到隨著EGCG濃度增大，測得的吸光度差值減小。當EGCG濃度達到1.024 mg/mL時，吸光度差值迅速減少，說明菌體生長被抑制(表1)，所以EGCG對大腸桿菌O157:H7 EDL933的MIC確定為1.024 mg/mL。

表1 EGCG對大腸桿菌O157:H7 EDL933 MIC測定的OD600值

EGCG終濃度/μg/mLEGCGOD600抑制后菌液OD600OD600差值0(陽性)0．0380．1920．15440．0560．210．15480．0570．2150．158160．0800．2390．159320．0730．2140．141640．0840．2170．1331280．0970．2260．1292560．1190．2610．1425120．2050．3870．18210240．4890．5010．012

3.2 生物膜形成實驗

將大腸桿菌O157:H7 EDL933分別接種于含不同濃度 EGCG的1/2 LB 液體培養基中，30 ℃下靜置培養5 d，結晶紫染色觀察。大腸桿菌O157:H7 EDL933的生物膜在培養基與空氣氣液交界面處形成，結晶紫與生物膜結合后，附著于玻璃試管內壁，形成藍紫色的生物膜環。脫色后測定OD595。由圖2可知， 陽性對照組形成生物膜量最多，OD595最大 ； 加入EGCG后，生物膜量減少，EGCG濃度越高，測得的OD595越小。

圖2 EGCG對大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜形成的影響

3.3 細菌泳動能力檢測結果

培養24 h后觀察菌落形態，各組細菌在軟瓊脂表面生長良好，形成圓形或近似圓形的大小不一的菌落。各組菌落直徑比較結果見圖3，含EGCG的實驗組細菌菌落直徑均極顯著小于PBS對照組(p<0.01)。大腸桿菌O157:H7 EDL933在含EGCG的軟瓊脂上的泳動能力弱于PBS對照組，表明低于MIC的EGCG對該菌泳動能力有抑制作用。

圖3 細菌泳動實驗結果

4 結論

EGCG屬于天然提取物，具有諸多保健功效，可以應用于食品保鮮中。大腸桿菌O157:H7是一種對人類健康危害極大的食源性致病菌。本文結果表明，低于MIC濃度的EGCG可以顯著抑制大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜的形成，抑制作用隨著EGCG濃度增大而增強。低于MIC濃度的EGCG可以顯著抑制大腸桿菌O157:H7 EDL933的泳動能力，EGCG的抑制作用隨濃度的增大而增強。

目前亞抑菌濃度的EGCG抑制細菌生物膜的相關報道較少。 Castillo等人 發現EGCG在亞抑菌濃度下可以顯著降低空腸彎曲桿菌的運動性，減少其生物膜的形成[12]。Blanco等人也報道了亞抑菌濃度的EGCG可抑制金黃色葡萄球菌的生物膜形成[13]。我們推斷，在亞抑菌濃度下，EGCG不能殺死細菌，因此EGCG抑制細菌生物膜形成主要是通過干擾細菌代謝、降低細菌運動性，減少細菌粘附到固體載體表面，從而減少生物膜形成。

本文證實亞抑菌濃度的EGCG 可顯著抑制大腸桿菌O157:H7 EDL933生物膜的形成，因此EGCG可用于食品工業中控制致病菌生長和生物膜的產生。本文結果為茶多酚開發做為天然食品保鮮劑提供了理論依據。

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Inhibition effects of Epigallocatechin gallate on the biofilm formation ofEscherichiacoliO157:H7

XIAOJie1,ZHANGXiu-qin2,DUWen-fang1,DUANHe-bo1,LIRui1

(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China; 2.Center for Detection and Inspection,Shennongjia Forestry District,Shennongjia 442400,China)

2017-08-01.

肖潔(1991) ，女，碩士研究生，E-mail：15827061924@163.com.

李睿(1972)，女，教授，博士，E-mail：liruiwuhan@163.com.

湖北省教育廳重點科研計劃項目(D20151702).

2095-7386(2017)03-0033-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.03.006

R 155.5

A