禾谷孢囊線蟲果膠酸裂解酶新基因Ha-pel-1的鑒定與表達特征分析

李新，顧曉川,2，龍海波，彭煥，黃文坤，彭德良

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禾谷孢囊線蟲果膠酸裂解酶新基因的鑒定與表達特征分析

李新1，顧曉川1,2，龍海波3，彭煥1，黃文坤1，彭德良1

（1中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京100193；2中國熱帶農業科學院橡膠研究所，海南儋州571737；3中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所農業部熱帶作物有害生物綜合治理重點實驗室，?？?71101）

【】禾谷孢囊線蟲（）是一種嚴重危害麥類作物的重要植物病原線蟲，對農業生產造成巨大的經濟損失，然而其致病機制和有效防控方法還有待進一步研究。通過克隆禾谷孢囊線蟲的果膠酸裂解酶新基因，并對其表達特性進行分析，為后續探究的基因功能及其與寄主的互作提供理論依據，并為探討禾谷孢囊線蟲防控途徑提供新思路?！尽坎捎猛纯寺〗Y合RACE技術從禾谷孢囊線蟲中克隆出一個新的果膠酸裂解酶基因；采用DNAMAN、Clustal、SignalP 4.0 Server和GSDS等相關生物信息學軟件和在線工具分析該基因的核苷酸和氨基酸序列，并使用MEGA 5.0構建系統進化樹；采用原位雜交和半定量PCR方法確定該基因的在禾谷孢囊線蟲中的表達部位及其在線蟲不同齡期中的表達情況?！尽繌暮坦孺吣揖€蟲中成功克隆出一個果膠酸裂解酶基因（GenBank登錄號GQ998895)，該基因cDNA全長1 717 bp，包含一個長度為1 563 bp的開放閱讀框，編碼一個長度為521個氨基酸殘基的蛋白，其理論分子量為57.5 kD，理論等電點為8.52。從線蟲基因組DNA中擴增獲得長度為7 199 bp的基因組全長，基因結構顯示分析發現，基因組包含14個外顯子和13個內含子，除第3個內含子剪接位點是GC-AG外，其余12個內含子都符合真核生物基因剪接位點GT-AG規則。同源比對結果表明，預測蛋白Ha-PEL-1的C端與大豆孢囊線蟲果膠酸裂解酶HG-PEL-1、甜菜孢囊線蟲果膠酸裂解酶HS-PEL-1均有67%的一致性和83%的相似性；此外，其N端信號肽后比報道的其他植物寄生線蟲果膠酸裂解酶多出一段長度為254個氨基酸殘基的序列，這段序列中，靠近N端的184個氨基酸殘基與數據庫中的蛋白均無相似性，而靠近C端有70個氨基酸殘基（Lys205—Glu274）與韋塞爾斯布朗病毒NS5蛋白（注冊號3ELD）的甲基轉移酶區域有32%的一致性和47%的相似性。氨基酸序列分析發現，預測蛋白Ha-PEL-1包含一個長度為20個氨基酸殘基的信號肽和4個果膠酸裂解酶第3家族（PL3）的高度保守區域以及多個保守的半胱氨酸殘基；系統進化分析發現，及其他已報道的線蟲果膠酸裂解酶基因與細菌和真菌來源的PEL聚在一個大的分支中；原位雜交結果顯示主要在禾谷孢囊線蟲亞腹食道腺中表達；半定量RT-PCR確定在寄生前和寄生后的2齡幼蟲中大量表達?！尽客ㄟ^對禾谷孢囊線蟲中一個新果膠酸裂解酶基因的克隆和表達特征分析，揭示該基因與禾谷孢囊線蟲的侵染和寄生過程密切相關。

禾谷孢囊線蟲；果膠酸裂解酶；基因克??；原位雜交；發育表達分析

0 引言

【研究意義】小麥禾谷孢囊線蟲（）是一種嚴重危害小麥（）、大麥（）和燕麥（）等禾谷類作物的重要病原線蟲[1]。自1874年在德國首次發現后，現已在全球40多個國家和地區發生與危害[2]。中國1989年在湖北省天門縣岳口鎮首次發現該病原線蟲[3]，隨著農業機械化和小麥跨區聯合收割，小麥孢囊線蟲病發生范圍迅速擴大，危害程度日趨嚴重，目前已擴散至全國16個?。ㄊ?、自治區）的小麥種植區[4]，對小麥等麥類作物的生產造成了嚴重的經濟損失[5]。研究表明，由植物線蟲食道腺細胞產生、并通過口針穿刺分泌到寄主植物組織中的纖維素酶、果膠酸裂解酶等一系列細胞壁降解酶類，在線蟲的侵染過程中，能夠降解和軟化細胞壁，從而有利于線蟲的寄生和遷移[6]。對重要的細胞壁降解酶——果膠酸裂解酶（pectate lyase，PEL）基因進行克隆和表達特性分析，可為后續探究的基因功能及其與寄主的互作機制提供理論依據，為從基因和蛋白水平上對禾谷孢囊線蟲進行防治打下基礎?！厩叭搜芯窟M展】2000年，Popeijus等首次從馬鈴薯金線蟲（）中發現果膠酸裂解酶基因[7]，隨后陸續從大豆孢囊線蟲（）、甜菜孢囊線蟲（）、馬鈴薯金線蟲、根結線蟲（spp.）、松材線蟲（）和燕麥真滑刃線蟲（）等多種植物線蟲中分離獲得該基因[8-16]?；蚪M數據分析預測顯示，松材線蟲、北方根結線蟲（）、南方根結線蟲（.）分別含有15、22和30個果膠酸裂解酶基因[17-19]。在大豆孢囊線蟲研究中，先后發現了兩類結構和功能具有顯著差異的果膠酸裂解酶基因，Bakhetia等[20]和Peng等[10]先后采用RNAi技術沉默了大豆孢囊線蟲的兩個果膠酸裂解酶基因（和），結果發現，當被沉默后，大豆孢囊線蟲在寄主體內的雌雄比發生變化，但是對侵染寄主根系的線蟲數量沒有影響；而沉默后，寄主根系內的線蟲數量和雌成蟲數均明顯下降，說明兩類結構和功能不同的果膠酸裂解酶在線蟲侵染過程發揮著不同的作用?！颈狙芯壳腥朦c】在前期研究中，禾谷孢囊線蟲中已分離克隆出多個與植物細胞壁降解相關的-1,4-內切葡聚糖酶基因（-1,4-endoglucanase gene）[21-22]、擴展蛋白基因（expansion gene）[23-24]和纖維素結合蛋白基因（CBP）[25]，但關于果膠酸裂解酶的研究未見報道?！緮M解決的關鍵問題】從禾谷孢囊線蟲中克隆獲得一個果膠酸裂解酶基因，對其序列特征、表達部位和發育動態進行系統研究，為進一步解析該類基因的功能打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2015年9月至2016年12月在中國農業科學院植物保護研究所完成。

1.1 線蟲材料

含有禾谷孢囊線蟲成熟孢囊的土樣采集于河南省濮陽市南樂縣。采用蔗糖離心法分離獲得孢嚢，并將挑取的孢囊在4℃條件下保存8周以上，然后放于16℃條件下中孵化2齡幼蟲[26]，參考亓曉莉等[27]方法，挑取單條線蟲進行分子檢測，確定為禾谷孢囊線蟲后，將其他2齡幼蟲接種到感病寄主小麥溫麥19的根系中，進行擴大培養，從根系和土壤中再次分離出來的孢囊，在4℃低溫刺激后，16℃孵化2齡幼蟲用于下一步研究。

1.2 試劑

Trizol Reagent、SuperScriptTMFirst-strand Synthesis System for RT-PCR反轉錄試劑盒、5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0 kit、Dynbeads?mRNA DIRECTTMKit購自Invitrogen公司；3′-Full RACE Core Set Ver.2.0購自Takara公司；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I、PCR DIG Probe Synthesis Kit、蛋白酶K購自Roche公司；RQ1 RNase-Free DNase、pGEM-T easy vector購自Promega公司；DNeasy Blood & Tissue Kit購自QIAGEN公司；DNA Marker、DH5感受態細胞、凝膠回收試劑盒購自北京天根生化有限責任公司；其他常規試劑購自Sigma等公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取 收集新鮮孵化的禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲置于1 mL的Trizol溶液中，參考彭煥等[28]方法提取總RNA，總RNA用RQ1 RNase-Free DNase進行去DNA處理，純化后產物置于-80℃保存。第一鏈cDNA的合成使用Invitrogen公司的SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR試劑盒，反轉錄產物置于-20℃保存。參照DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒說明書提取禾谷孢囊線蟲基因組DNA。

1.3.2 RACE 擴增3′端和5′端序列 根據已報道的植物寄生線蟲果膠酸裂解酶蛋白序列，參照Takara公司3′-Full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒引物設計說明，采用Primier 5.0軟件，設計3′ RACE反應的簡并引物（JPL-O和JPL-I，表1），以2齡幼蟲總RNA為模板，進行3′末端擴增，具體步驟參照試劑盒說明書，然后對擴增片段進行回收、連接、轉化、送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。再根據已測序獲得的基因3′末端片段序列，參考Invitrogen公司5′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0 kit試劑盒引物設計說明，設計的5′ RACE特異引物（GSP-PL1、GSP-PL2和GSP-nPL4，表1），以2齡幼蟲總RNA為模板，進行5′末端擴增，具體步驟參照試劑盒說明書，對擴增片段進行回收、連接、轉化、測序。

1.3.3 cDNA全長和基因組DNA克隆 根據已測序獲得的基因cDNA拼接全長序列，設計全長引物（PEL-L1和PL-LA2，表1），以第一鏈cDNA和基因組DNA為模板，分別進行PCR擴增。反應參數：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min；35個循環；72℃延伸10 min；對擴增片段進行回收、連接、轉化、測序。

1.3.4 序列分析 分別使用DNAMAN和Clustal軟件進行核苷酸序列的翻譯和氨基酸序列的比對分析，使用在線工具（http://www.expasy.ch/tools/ pi_tool.html/）進行蛋白質等電點和分子量的預測，使用SignalP 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）預測蛋白質前體信號肽[29]，使用CBS Prediction Servers（http://www.cbs.dtu.dk/services/）對氨基酸序列中可能存在的糖基化位點和磷酸化位點進行預測，使用基因內含子分析工具（http://gsds.cbi.pku. edu.cn/）分析基因組結構[30]，使用MEGA 5.0構建系統進化樹[31]。

1.3.5 原位雜交 原位雜交方法參考De Boer等[32]的方法進行，收集新孵化的禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲用DEPC水清洗3次，4%多聚甲醛固定24 h，用手術刀將蟲體切斷后，采用甲醇和丙酮進行通透，蛋白酶K進行消化，再用1倍雜交液重懸并置于-20℃保存。根據全長序列設計特異性引物Yw-F和Yw-R（表1），以cDNA第一鏈為模板加入DIG標記的dNTP進行正、負鏈探針合成。將合成的DIG標記探針與預處理的禾谷孢囊線蟲參考DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅰ說明書進行雜交和洗脫，停止顯色后，在Leica DM2500顯微鏡下進行觀察拍照。

1.3.6 發育表達分析 參考Long等[22]方法，通過控制接種時間結合酶裂解處理分離獲得5種不同發育階段的禾谷孢囊線蟲（侵染前2齡幼蟲、侵染后2齡幼蟲、3齡幼蟲、4齡幼蟲和雌蟲）。采用Dynbeads?mRNA DIRECTTMKit提取不同齡期禾谷孢囊線蟲mRNA，并取等量mRNA（200 ng）分別反轉錄合成第一鏈cDNA。分別以5個不同發育階段線蟲的第一鏈cDNA和小麥根系的第一鏈cDNA為模板，采用特異引物RT-F和RT-R（表1）進行PCR 擴增，30個循環，同時以引物ActinF和ActinR（表1）擴增禾谷孢囊線蟲的作為陽性對照。擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳分離檢測。

表1 本研究中的引物序列

2 結果

2.1 核酸提取及Ha-pel-1克隆

采用Trizol法提取的禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲總RNA，電泳分離檢測可見總RNA的28S、18S和5S 3條清晰的帶，其OD260/280值為1.9—2.0，說明蛋白質和DNA去除較徹底，RNA純度較高，可以用于后續試驗。電泳檢測提取的禾谷孢囊線蟲基因組DNA，獲得大小為23 kb左右的完整條帶，無拖尾和降解，完整性較好，可用于下游試驗。

通過同源克隆策略，采用3′ RACE技術擴增獲得長度為280 bp的禾谷孢囊線蟲果膠酸裂解酶基因cDNA 3′末端片段（圖1-A），BLAST比對分析表明，該片段與已報道的線蟲果膠酸裂解酶基因具有較高的同源性。在此基礎上，采用5′ RACE技術獲得長度為1 499 bp的cDNA 5′末端片段（圖1-B）。為驗證拼接序列的準確性，采用全長引物從禾谷孢囊線蟲cDNA模板中擴增獲得到長度1 682 bp，包含完整ORF的cDNA全長序列（圖1-C）；采用分步克隆和序列拼接，從禾谷孢囊線蟲基因組DNA中擴增獲長度為7 199 bp的基因組全長。

1：PCR產物Product of PCR；M1：DL 2000 plus marker；M2：DL 2000 marker

2.2 Ha-pel-1序列分析

序列分析結果表明，（GenBank登錄號GQ998895）cDNA全長為1 717 bp（不包含多聚腺苷酸尾）（圖2），其中5′端非編碼區（UTR）為98 bp，3′端非編碼區為56 bp，開放閱讀框為1 563 bp，編碼一個長度為521個氨基酸殘基的蛋白，其理論分子量為57.5 kD，理論等電點為8.52。SignalP預測發現，Ha-PEL-1蛋白N端含有一個長度為20個氨基酸殘基的信號肽，剪接位點在Gly20和Arg21之間。糖基化位點預測顯示，該蛋白在Asn38存在一個N位糖基化位點?；蚪Y構顯示分析發現，基因組含有14個外顯子和13個內含子，除第3個內含子的剪接位點為GC-AG外，其余12個內含子都符合真核生物基因剪接位點GT-AG規則，其中相位0的內含子有5個，相位1的內含子有6個，相位2的內含子有2個。

圖2 Ha-pel-1基因組DNA結構分析

2.3 Ha-PEL-1氨基酸序列分析及系統進化分析

NCBI中BLASTp比對分析發現，Ha-PEL-1預測蛋白C端的247個氨基酸殘基與已報道的大豆孢囊線蟲果膠酸裂解酶HG-PEL-1、甜菜孢囊線蟲HS-PEL-1均有67%的一致性和83%的相似性，與大豆孢囊線蟲HG-PEL-2和馬鈴薯孢囊線蟲GR-PEL-1的相似性分別為82%和81%；其N端信號肽后的254個氨基酸殘基與GenBank蛋白數據庫中的蛋白無相似性，而與RCSB Protein Data Bank比對后發現，這段氨基酸序列后70個氨基酸殘基（Lys205—Glu274）與RCSB蛋白質數據庫中韋塞爾斯布朗病毒NS5蛋白（注冊號3ELD）甲基轉移酶區域的71個氨基酸殘基具有32%的一致性和47%的相似性。

多序列比對和保守結構域分析表明，預測蛋白Ha-PEL-1具有果膠酸裂解酶第3家族（PL3）的4個保守區域和多個保守的半胱氨酸殘基，同時，在Ha-PEL-1上發現一個帶負電荷的保守天冬氨酸和兩個帶正電荷的保守賴氨酸，可以確定Ha-PEL-1是果膠酸裂解酶第3家族的新成員。

采用ME法構建了Ha-PEL-1及42個已報道的植物線蟲、真菌和細菌來源的果膠酸裂解酶的系統發育樹。結果顯示，所有植物線蟲來源的果膠酸裂解酶聚為3個獨立的分支，其中燕麥滑刃線蟲AA-PEL-1和AA-PEL-2、松材線蟲BX-PEL-1和BX-PEL-2、擬松材線蟲（）BM-PEL-1和BM-PEL-2、馬鈴薯孢囊線蟲HG-PEL-2、甜菜孢囊線蟲HS-PEL-2和大豆孢囊線蟲HG-PEL-5聚為一個分支，命名為Nematode PEL-1；南方根結線蟲MI-PEL-1和爪哇根結線蟲（）MJ-PEL-1聚在另一個分支，命名為Nematode PEL-2；而禾谷孢囊線蟲Ha-PEL-1與大豆孢囊線蟲HG-PEL-1和HG-PEL-2、甜菜孢囊線蟲HS-PEL-1、馬鈴薯孢囊線蟲GR-PEL-1、南方根結線蟲MI-PEL-2和MI-PEL-3聚為一個分支，命名為Nematode PEL-3。其中第1分支Nematode PEL-1和第2分支Nematode PEL-2又與芽孢桿菌（sp.）、番茄細菌性潰瘍病菌（）等的果膠酸裂解酶聚在一個大分支上，第3分支Nematode PEL-3與菊歐式桿菌（）、纖維堆囊菌（）等細菌聚為一支（圖3）。

2.4 Ha-pel-1組織定位

采用原位雜交方法明確了在禾谷孢囊線蟲中的表達部位。地高辛標記的負鏈探針雜交結果表明，在禾谷孢囊線蟲的兩個亞腹食道腺細胞中有明顯雜交信號（圖4-A），而作為對照的正鏈探針無雜交信號（圖4-B），由此確定在禾谷孢囊線蟲的亞腹食道腺細胞中特異表達。

2.5 Ha-pel-1發育表達分析

采用半定量RT-PCR方法對在禾谷孢囊線蟲5個不同發育階段中的表達差異進行了分析。結果表明，主要在禾谷孢囊線蟲寄生前2齡幼蟲和寄生后2齡幼蟲中表達，而在寄生后期和雌成蟲中表達量很低甚至檢測不到，內標基因在各個齡期中均有表達，在小麥根系DNA的陰性對照中未檢測到和的表達（圖5）。

淺色部分：線蟲PEL；深色部分：真菌PEL；無底色部分：細菌PEL；下劃線：Ha-PEL-1

3 討論

植物細胞壁是寄主植物抵御外界病原物侵染的物理屏障，其主要成分為纖維素、果膠質和半纖維素等，降解和軟化植物細胞壁是植物線蟲成功侵染和寄生的關鍵。目前的研究結果表明，植物線蟲能從食道腺細胞中分泌一系列的細胞壁修飾酶類，共同作用于植物細胞壁，從而利于線蟲侵染和寄生[6,33-34]，其中果膠酸裂解酶在植物細胞壁降解過程中發揮著不可替代的作用。本研究從禾谷孢囊線蟲中分離出一個果膠酸裂解酶基因，并對其序列結構、系統進化關系及表達特性進行了系統研究。

結構域分析發現，Ha-PEL-1氨基酸序列C端有一個長度為247個氨基酸殘基的果膠酸裂解酶區域，比報道的其他植物寄生線蟲果膠酸裂解酶氨基酸序列多出一段長度為250個氨基酸左右的序列。這段序列中，靠近N端的184個氨基酸殘基與數據庫中的蛋白均無相似性，而靠近C端有70個氨基酸殘基與韋塞爾斯布朗病毒NS5蛋白（注冊號3ELD）的甲基轉移酶區域有32%的一致性和47%的相似性。韋塞爾斯布朗病毒是一種危害人類的病毒，其NS5蛋白參與了病毒復制，該蛋白的甲基轉移酶區域能夠參與RNA的加帽反應，催化RNA的甲基化[35]。到目前為止，在其他病原線蟲的果膠酸裂解酶中均未發現該結構域。在Ha-PEL-1中，果膠酸裂解酶結構域與類似甲基轉移酶結構域結合在一起，該段與韋塞爾斯布朗病毒NS5蛋白具有相似性的氨基酸序列是否也具有甲基轉移酶功能，有待于今后進一步研究。

A：Ha-pel-1負鏈探針雜交In situ hybridization of digoxigenin-labelled antisence probes of Ha-pel-1；B：Ha-pel-1正鏈探針雜交In situ hybridization of digoxigenin-labelled sence probes of Ha-pel-1；S：口針Stylet；M：中食道球Metacorpus；G：亞腹食道腺Subventral oesophageal gland region

1：侵染前2齡幼蟲Pre-parasitic 2nd stage juveniles；2：侵染后2齡幼蟲Parasitic 2nd stage juveniles；3：3齡幼蟲Parasitic 3rd stage juveniles；4：4齡幼蟲Parasitic 4th stage juveniles；5：雌蟲Adult females；6：陰性對照Negative control

序列同源比對結果顯示，禾谷孢囊線蟲Ha-PEL-1與大豆孢囊線蟲HG-PEL-1、HG-PEL-2，甜菜孢囊線蟲HS-PEL-1和馬鈴薯孢囊線蟲GR-PEL-1的相似度高達81%—83%；進化分析也發現上述果膠酸裂解酶序列被聚類到同一個分支中，連同南方根結線蟲MI-PEL-2和MI-PEL-3，聚為線蟲果膠酸裂解酶的第3分支Nematode PEL-3；兩個根結線蟲果膠酸裂解酶聚在一起單獨形成線蟲果膠酸裂解酶的第2分支Nematode PEL-2；其他的線蟲果膠酸裂解酶則聚為第1分支Nematode PEL-1，推測這些植物線蟲PEL可能具有3個不同的進化起源。此外，這3個線蟲果膠酸裂解酶進化分支均與細菌或真菌來源的果膠酸裂解酶聚在一起，在植物寄生線蟲的其他細胞壁降解酶中也曾發現類似現象，如纖維素酶和擴展蛋白等[36]，由上述結果推測植物線蟲PEL的起源可能與其他微生物的基因水平轉移有關，而植物寄生線蟲分泌細胞壁降解酶也正是線蟲與真菌和細菌之間存在基因水平轉移的重要證明[36]。綜上所述，本研究結果為植物寄生線蟲果膠酸裂解酶的起源過程提供了新的依據。

原位雜交結果發現，在禾谷孢囊線蟲的亞腹食道腺細胞中特異表達，這與其他的植物寄生線蟲的PEL，如HG-PEL-1和HG-PEL-2、HS-PEL-1和HS-PEL-2、GR-PEL-1等的表達部位一致[7-16]，此外，Ha-PEL-1蛋白N端具有信號肽，推測Ha-PEL-1是由禾谷孢囊線蟲亞腹食道腺細胞合成，并通過口針分泌到寄主體內；同時，禾谷孢囊線蟲亞腹食道腺細胞也是其他細胞壁降解酶類的合成場所[21-24]。

突破植物細胞壁的物理屏障是植物線蟲成功寄生的關鍵，在禾谷孢囊線蟲侵染過程中，食道腺細胞會分泌一系列細胞壁降解酶類如果膠酸裂解酶、-1,4-內切葡聚糖酶[21-22]和擴展蛋白[23-24]等分泌物，協同口針穿刺的機械壓力來完成對寄主的侵染和早期寄生。禾谷孢囊線蟲在5個不同齡期的表達分析顯示，該基因在寄生前2齡幼蟲和寄生后2齡幼蟲中大量表達，在寄生后期和雌成蟲中表達量非常低或者不表達；Long等研究發現禾谷孢囊線蟲-1,4-內切葡聚糖酶Ha-eng-1a、Ha-eng-2和Ha-eng-3及擴展蛋白Ha-EXPB1、HaEXPB2也均在侵染和寄生早期大量表達，由此推測可能在禾谷孢囊線蟲侵染植物寄主的過程中與上述兩類蛋白共同發揮作用[21-24]。

本研究從禾谷孢囊線蟲中克隆獲得一個果膠酸裂解酶基因，并對其序列特征、組織定位和發育表達進行了系統分析，結果可為明確在禾谷孢囊線蟲與寄主互作過程中的功能研究打下基礎，并為探究植物寄生線蟲果膠酸裂解酶的起源提供了新的證據，后續將利用RNAi等技術，進一步對進行功能驗證；此外，Ha-PEL-1中與韋塞爾斯布朗病毒NS5蛋白甲基轉移酶區域相似的氨基酸序列是否也具有甲基轉移酶功能，仍有待進一步研究。

4 結論

從禾谷孢囊線蟲中克隆獲得一個新的果膠酸裂解酶基因，該基因cDNA全長1 717 bp，編碼一個長度為521個氨基酸殘基的蛋白Ha-PEL-1；基因組全長為7 199 bp，包含14個外顯子和13個內含子。對其序列特征和表達特性進行系統研究表明，在Ha-PEL-1中，類似甲基轉移酶結構域與果膠酸裂解酶結構域結合在一起；Ha-PEL-1屬于果膠酸裂解酶第3家族，根據進化分析推測其起源可能與其他微生物的基因水平轉移有關；主要在禾谷孢囊線蟲寄生前和寄生后的2齡幼蟲的亞腹食道腺中大量表達，揭示該基因與禾谷孢囊線蟲的侵染和寄生過程密切相關。

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（責任編輯 岳梅）

Identification and expression analysis of a new pectate lyase genefrom

LI Xin1, GU XiaoChuan1,2, LONG HaiBo3, PENG Huan1, HUANG WenKun1, PENG DeLiang1

(1Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, Hainan;3Key Laboratory of Pests Comprehensive Governance for Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101)

【】The cereal cyst nematode () is one of the important plant parasitic nematodes which seriously threatened cereal crops and caused huge economic losses to agricultural production in China. However, its pathogenic mechanism and effective prevention and control methods still need to be further studied. The objective of this study is to provide a theoretical basis for further study on the gene function ofand its interaction with host plants, and to give new ideas for the control strategies of cereal cyst nematode based on the cloning and expression analysis of a new pectate lyase genefrom.【】A novel pectate lyase genewas cloned fromusing homology cloning combined with RACE technology, and its nucleotide sequence and amino acid sequence were analyzed by related bioinformatics softwares and online tools, such as DNAMAN, Clustal, SignalP 4.0 Server and GSDS. a phylogenetic tree was also constructed using MEGA 5.0. the tissue localization and developmental expression characteristics ofwere analyzed byhybridization and semi-quantitative PCR method. 【】A novel pectate lyase gene (, GenBank accession number GQ998895) was cloned successfully from.was 1 717 bp in length which contained a 1 563 bp open reading frame (ORF) encoding a protein of 521 amino acid residues. The molecular weight ofencoding protein was 57.5 kD and isoelectric point was 8.52. The full length of genomic sequence ofwas amplified from the nematode genome DNA which contains 7 199 bp. Gene structure analysis showed that thegenome contains 14 exons and 13 introns, except for the 3rd intron splice sites are GC-AG, the other 12 introns are in line with the rules of the eukaryotic gene splicing site GT-AG. The results of homologous comparison showed that the C-terminal sequence of the putative Ha-PEL-1 had a 67% identity and a similarity of 83% with that of soybean cyst nematode HG-PEL-1 and beet cyst nematode HS-PEL-1. In addition, after the end of N-terminal signal peptide, the putative Ha-PEL-1 had a sequence of 254 amino acid residues more than other reported plant parasitic nematodes pectate lyases. In this sequence, 184 amino acid residues closing to the N-terminal had no similarity with protein database, while 70 amino acid residues (Lys205-Glu274) closing to the C-terminal had an identity of 32% and a similarity of 47% with the methyltransferase domain of Wesselsbron virus NS5 (Registration No. 3ELD). The amino acid sequence analysis revealed that the predicted protein contained a signal peptide of 20 amino acid residues, as well as 4 highly conserved regions and several conserved cysteine residues characteristic of class Ⅲ pectate lyases (PL3). A phylogenetic analysis revealed thatand other nematodes pectate lyase genes are gathered in a large branch with bacterial and fungal sources PEL.hybridization analyses showed that the transcripts ofwere mainly expressed in the two subventral gland cells of. a semi-quantitative RT-PCR analysis confirmed that its transcriptions were highly expressed at the pre-parasitic and parasitic 2nd stage juveniles.【】A new pectate lyase genefrom, closely related to the infection and parasitic process of cereal cyst nematode, was found and analyzed.

; pectate lyase; gene cloning;hybridization; developmental expression analysis

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.009

2017-03-30；接受日期：2017-05-08

國家“973”計劃（2013CB127502）、國家公益性行業（農業）科研專項（201503114）

李新，E-mail：lixin9745@163.com。通信作者彭德良，Tel：010-62815611；E-mail：dlpeng@ippcaas.cn