Gli1基因在胃癌組織中的表達及其對胃癌細胞生物學特性的影響

楊冬野，焦 洋，檀碧波，杜志堅，胡曉杰，劉 飛

(1.河北省人民醫院普外四科，河北 石家莊 050051；2. 河北省人民醫院消化二科，河北 石家莊 050051；3.河北醫科大學第四醫院外三科，河北 石家莊 050011)

雖然近幾十年對胃癌的研究不斷深入并取得了較多成就，但是目前胃癌的發病機制尚未闡明，胃癌診治效果也沒有取得突破性進展，因此尋找新的調控胃癌進展的基因對胃癌的綜合診治有重要意義。研究[1-5]表明：膠質瘤相關癌基因1(glioma-associated oncogene 1,Gil1)作為腫瘤發生、發展和侵襲的重要相關因素，近年來也被證實在多種人類腫瘤發生發展中發揮關鍵作用，如非小細胞肺癌和基底細胞癌等。有研究[6]表明：特異性抑制Gli1表達能介導胃癌細胞凋亡。目前關于Gli1在胃癌的發生發展過程中的作用及機制還缺少深入的實驗研究。RNA 干擾(RNA interference,RNAi)進行特異性基因表達抑制的核酸操作技術，現已成為研究腫瘤基因治療的有力工具[7]。因此，本研究對Gli1在胃癌組織中的表達進行探討，并利用RNA 干擾技術以Gli1基因為靶點，研究Gli1對胃癌細胞生物學特性的影響及機制，為闡明胃癌進展機制提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2015年8月—2016年12月于河北省人民醫院普通外科及河北醫科大學第四醫院普通外科手術切除、病理證實的胃癌患者95例，其中男性47例，女性48例，中位年齡66歲，分別選取胃癌組織和癌旁組織(距腫瘤邊緣≥3 cm、鏡檢未見癌細胞)，標本于術中離體后分為2份，一份于液氮速凍，并轉入-80℃凍存；另一份于中性甲醛中固定。人胃癌細胞株MKN28、SGC7901、BGC823和胃上皮細胞株GES-1購自中科院上海細胞研究所。CCK-8(日本同仁公司)，RPMI 1640培養液和胰蛋白酶(美國Gibco公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，兔抗人Gli1、P27、MMP-2、MMP-9及β-actin多克隆抗體(美國Sigma公司)，免疫組織化學試劑盒購自北京中杉公司。各基因的PCR引物由上海吉瑪技術公司合成。

1.2 細胞培養人胃癌MKN28、SGC7901、BGC823細胞株和胃永生化上皮細胞株GES-1置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，在含5% CO2、37℃條件下恒溫孵育，2～3 d傳代1次。細胞用含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代，實驗時將生長至60%～70%融合的細胞消化后制成細胞懸液備用。

1.3 實時定量熒光PCR(RT-qPCR)法檢測胃癌組織、癌旁組織和人胃癌細胞中Gli1 mRNA表達水平利用Trizol法提取胃癌組織、癌旁組織和胃癌細胞中的總RNA，檢測提取的RNA的純度。按照逆轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄成cDNA，按照RT-qPCR試劑盒操作說明書進行目的基因的擴增。以GAPDH作為內參，根據Ct值按照2-△△Ct方法計算mRNA表達水平。每組實驗重復3次，取平均值。

1.4 免疫組織化學法檢測Gli1蛋白在胃癌組織中的表達采用免疫組織化學技術檢測Gli1蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達。嚴格按試劑盒說明書進行操作。Gli1蛋白以細胞質和/或細胞膜出現黃色或褐色顆粒為染色陽性，計算陽性表達率。

1.5 BGC823細胞轉染后Gli1 mRNA表達水平檢測將轉染后的BGC823細胞分為正常培養的細胞(對照組)、轉染NS-siRNA細胞(NS-siRNA組)和轉染Gli1-siRNA細胞(Gli1-siRNA組)，按照RT-qPCR試劑盒操作說明書檢測各組細胞中Gli1 mRNA表達。每組設6個復孔。

1.6 CCK8法檢測細胞增殖率細胞分組同上。各組細胞培養結束后棄去培養基，按CCK-8試劑盒說明書加入含有CCK-8的培養基(CCK-8溶液∶培養基=1∶10) 100 μL，37℃孵育1 h，酶標儀450 nm處測定各孔吸光度(A)值，計算細胞增殖率，細胞增殖率=(給藥孔平均A值/ 對照孔平均A值)×100%。實驗重復3次。

1.7 Transwell小室法檢測細胞遷移能力細胞分組同上。消化各組細胞后，PBS清洗1或2次，含1%BSA無血清1640培養基調整BGC823細胞濃度為l×106mL-1，取BGC823細胞懸液200 μL加入Transwell小室的上室，常規培養24 h，取出小室，濕棉簽擦除上室內的BGC823細胞，結晶紫染色后在顯微鏡下(×400)計數穿膜的BGC823細胞數目，以穿膜細胞數表示細胞遷移能力。

1.8 Western blotting法檢測各組細胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平細胞分組同上。取1×107個細胞，加入細胞裂解液100 μL裂解。4℃、8 000 r·min-1離心10 min。Bradford法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品,10%十二烷基硫酸鈉(Sodiumdodecylsulfate，SDS) 聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分離，電轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，分別加入稀釋的Gli1、P27、MMP-2和MMP-9一抗，4℃過夜。加入二抗，曝光、顯影、定影。以蛋白條帶的平均吸光度(A)值表示蛋白相對表達水平。

2 結 果

2.1 胃癌組織和癌旁組織中Gli1 mRNA表達水平和Gli1蛋白陽性表達率RT-qPCR法和免疫組織化學法檢測95例胃癌組織和癌旁組織中Gli1基因的表達。胃癌組織中Gli1 mRNA表達水平(1.00±0.18)明顯高于癌旁組織(0.43±0.09)(t=27.606,P<0.01)；胃癌組織中Gli1蛋白陽性表達率(75.79%，72/95)明顯高于癌旁組織(22.11%，21/95)(χ2=54.782，P<0.01)。見圖1(插頁三)。

2.2 不同細胞中Gli1 mRNA的表達水平以胃上皮細胞株GES-1為參照，采用RT-qPCR法檢測Gli1 mRNA在胃癌細胞株MKN28、SGC7901和BGC823的表達水平。GES-1、MKN28、SGC7901和BGC823細胞中Gli1mRNA相對表達水平分別為1.00±0.09、2.17±0.23、3.32±0.39和5.57±0.62，多組間比較差異有統計學意義(F=86.341,P<0.01)。組間兩兩比較：GES-1與MKN28、GES-1與SGC7901、GES-1與BGC823、MKN28與SGC7901、MKN28與BGC823和SGC7901與BGC823比較差異均有統計學意義(P<0.01)。胃癌細胞株BGC823中Gli1 mRNA表達最高，故選擇BGC823做后續研究。

2.3 轉染后各組細胞中Gli1 mRNA表達水平3組細胞中Gli1 mRNA表達水平分別為：對照組100.00%±9.17%，con-siRNA組98.57%±9.53%，Gli1-siRNA組57.28%±6.06%，Gli1-siRNA組 Gli1 mRNA表達水平明顯低于對照組和con-siRNA組(F=48.322，P<0.01)。

2.4 各組胃癌細胞增殖率轉染后24 h，Gli1-siRNA組細胞增殖率(62.01%±6.31%)明顯低于對照組(100.00%±7.97%)和con-siRNA組(88.75%±8.19%)(F=54.428,P<0.01)。

2.5 各組胃癌細胞遷移能力Gli1-siRNA組穿膜細胞數(63±7)低于對照組(155±15)和con-siRNA組(151±13)(F=257.788,P<0.01)。

2.6 各組胃癌細胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平Gli1-siRNA基因轉染細胞后，采用Western blotting法檢測各組細胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平。與對照組比較，con-siRNA組細胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)；與con-siRNA組比較，Gli1-siRNA組P27蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表1和圖2。

表1 各組胃癌細胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平

*P<0.05 compared with con-siRNA group.

Lane 1:Control group;Lane 2:Con-siRNA group;Lane 3:Gli1-siRNA group.

3 討 論

胃癌是我國常見的消化系統惡性腫瘤，治療效果及預后均不理想，因此探索新的治療方法已成為胃癌治療亟待解決的問題。研究[8]表明：基因治療在癌癥病因治療中發揮著重要作用。Hedgehog信號通路自1980年被發現以來，其作用逐漸被人們認識。作為來自內胚層的信號分子之一，Shh信號通路在胚胎發育、成熟器官形成及形態維持中扮演重要角色。近年來研究[9-10]顯示：Sonic Hedgehog信號通路是參與多種腫瘤侵襲轉移的重要信號通路之一。Gli1是Hedgehog信號通路的核心成員，發揮著通路功能調節作用[11]。研究[12]顯示：Gli1在胃癌組織中高表達。但目前對Gli1基因是否影響胃癌細胞的遷移及其機制仍缺乏相關文獻報道。

本研究對胃癌組織和癌旁組織中Gli1基因表達檢測結果顯示：Gli1基因在胃癌組織中表達上調，提示Gli1基因的異常激活可能參與胃癌的侵襲與轉移過程。

本研究又進一步在細胞水平上利用Gli1-siRNA技術抑制Gli1后觀察胃癌細胞的增殖和遷移及其可能機制，結果顯示：與對照組和con-siRNA組比較，Gli1-siRNA組細胞活性受到明顯抑制；Transwell小室法檢測細胞遷移，Gli1-siRNA轉染后胃癌細胞遷移數目明顯減少。本研究結果表明：抑制細胞中Gli1基因表達可降低胃癌細胞增殖能力和遷移侵襲能力，因此Gli1基因可能成為胃癌潛在的治療靶基因。

為進一步探討Gli1基因對胃癌細胞的增殖和遷移作用的可能機制，根據文獻報道P27蛋白參與調控腫瘤細胞的增殖，當P27蛋白表達增加時，其增殖受到抑制[13]。MMP在腫瘤細胞的侵襲和轉移中發揮重要的作用，其中，對通路中某些節點(如MMP-2和MMP-9)研究成為目前的研究熱點[14-17]。本研究檢測了Gli1-siRNA轉染后胃癌細胞中P27、MMP-2和MMP-9蛋白表達的變化，本研究結果顯示：抑制細胞Gli1表達后，P27的蛋白表達水平上調，而MMP-2、MMP-9的蛋白表達水平下調，提示抑制Gli1后可通過調控遷移侵襲相關因子而發揮對胃癌細胞的抑制作用，但其具體的分子作用機制仍需進一步研究。

[1] Inaguma S,Riku M,Ito H,et al. GLI1 orchestrates CXCR4/CXCR7 signaling to enhance migration and metastasis of breast cancer cells[J]. Oncotarget,2015,6(32):33648-33657.

[2] Wahid M,Jawed A,Mandal RK,et al.Vismodegib,itraconazole and sonidegib as hedgehog pathway inhibitors and their relative competencies in the treatment of basal cell carcinomas[J].Crit Rev Oncol Hematol,2016,98:235-241.

[3] Athar M,Li C,Kim AL,et al.Sonic hedgehog signaling in Basal cell nevus syndrome[J].Cancer Res,2014,74(18):4967-4975.

[4] Bermudez O,Hennen E,Koch I,et al.Gli1 mediates lung cancer cell proliferation and Sonic Hedgehog-dependent mesenchymal cell activation[J].PLoS One,2013,8(5):e63226.

[5] Chen JS,Li HS,Huang JQ,et al.Down-regulation of Gli-1 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration and invasion[J].Mol Cell Biochem,2014,393(1/2):283-291.

[6] 王 雷，杜媛鯤，米 源， 等． Gli抑制劑誘導胃癌細胞凋亡作用的研究[J]． 重慶醫學，2016，45(29)：4050-4052.

[7] Takei Y,Kadomatsu K,Yuzawa Y,et al.A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics [J].Cancer Res,2004,64(10):3365-3370.

[8] Lichtenstein P,Holm NV,Verkasalo PK,et al.Environmental and heritable factors in the causation of cancer:analyses of cohorts of twins from Sweden,Denmark,and Finland[J].Surv Ophthalmol,2000,45(2):167-175.

[9] Yoo YA,Kang MH,Kim JS,et al.Sonic hedgehog signaling promotes motility and invasiveness of gastric cancer cells through TGF-beta-mediated activation of the ALK5-Smad 3 pathway[J].Carcinogenesis,2008,29(3):480-490.

[10]梁新軍，魏少忠．Shh信號通路阻斷對人結腸癌細胞HT-29增殖、侵襲的影響及機制探討[J].山東醫藥，2016，56(18)：12-14．

[11]Fu J,Rodova M,Roy SK,et al.GANT-61 inhibits pancreatic cancer stem cell growth in vitro and in NOD/SCID/IL2R gamma null mice xenograft[J].Cancer Lett,2013,330(1):22-32.

[12]Abdel-Rahman O.Hedgehog pathway aberrations and gastric cancer; evaluation of prognostic impact and exploration of therapeutic potentials[J].Tumour Biol,2015,36(3):1367-1374.

[13]Dong LH,Wen JK,Miao SB,et al.Baicalin inhibits PDGF-BB-stimulated vascular smooth muscle cell proliferation through suppressing PDGFRβ-ERK signaling and increase in p27 accumulation and prevents injury-induced neointimal hyperplasia[J].Cell Res,2010,20(11):1252-1262.

[14]Xu H,Xu Y,Zhang W,et al.Aquaporin-3 positively regulates matrix metalloproteinases via PI3K/AKT signal pathway in human gastric carcinoma SGC7901 cells[J].J Exp Clin Cancer Res,2011,30:86.

[15]丁順斌,王簡勤，蔡明春，等．miR-630在胃癌組織中的表達變化及對胃癌細胞SGC-7901增殖、侵襲能力的影響[J].山東醫藥，2017，57(15)：9-12．

[16]張志棟，李 勇，檀碧波，等.胃癌患者癌組織膜聯蛋白A2的表達與血清膜聯蛋白A2及癌胚抗原水平測定[J].鄭州大學學報：醫學版，2016,51(1):76-79.

[17]姜文靜，張忠獻，王堯河，等.腹水來源胃癌原代細胞的建立及鑒定[J].鄭州大學學報：醫學版，2016，51(4):498-502.