血管內皮生長因子165b對人肝癌HepG2細胞生物學特性的影響

趙燕穎，王秀巖，秦國濤，孫遠杰，劉志忠，李然偉

(1.吉林大學第四醫院消化內科，吉林 長春130011；2.吉林大學第二醫院泌尿外科，吉林 長春130041)

腫瘤轉移是導致腫瘤患者死亡的一個重要因素。腫瘤血管形成是腫瘤細胞轉移的重要因素。腫瘤血管形成受多種細胞因子調節，血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 是最重要的調節因子之一[1-2]，其中VEGF165是體內含量最多和最為重要的的亞型，而新發現的VEGF變構體VEGF165b具有抑制VEGF165的血管內皮細胞增殖和遷移的作用[3]。目前國內外尚無關于VEGF165b對于肝癌HepG2細胞生物學特性影響的報道。本研究擬觀察人肝細胞癌HepG2細胞轉染表達VEGF165b的質粒后VEGF165b和VEGF165 mRNA和蛋白的表達情況，以及肝癌細胞生存率和遷移能力的變化，進一步探索VEGF165b對肝癌生物學特性的影響，為臨床肝癌的靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑可表達VEGF165b的合成質粒PcDNA-VEGF165b由吉林大學第二醫院李然偉教授惠贈。胎牛血清和IMDM培養基購自美國Gibco公司，RT-PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，VEGF165b和VEGF165一抗購自英國Abcam公司，二抗、Western blotting Luminol Reagent和PVDF 膜購自美國Santa Cruz 公司。引物由上海生工生物工程公司合成。Matrigel和Transwell小室購自美國BD公司。

1.2 細胞培養及轉染HepG2人肝癌細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所。細胞在IMDM培養液(含10%胎牛血清,青霉素100 mg·L-1,鏈霉素100 mg·L-1)中,5%CO2孵箱內37℃培養。取對數生長期的細胞經胰酶消化后接種于孔板或培養瓶后再用無抗生素IMDM培養,細胞融合率達80%～95%時可以轉染。細胞分為空白組(只加轉染試劑)、對照組(轉染陰性對照PcDNA3.0表達載體)和PcDNA-VEGF165b組(轉染PcDNA-VEGF165b表達載體)。操作按LipofectamineTM2000試劑說明書進行，轉染后6～24 h換液1次,繼續培養。

1.3 MTT法檢測HepG2細胞的增殖按照5×103個細胞/孔將對數生長期細胞接種于96孔板,培養至細胞80%融合后分為空白組、對照組和PcDNA-VEGF165b組,分別轉染LipofectamineTM2000、PcDNA3.0和PcDNA-VEGF165b(終濃度均為50 nmol·L-1)。分別于轉染后24、48和72 h,每孔加入15 μL MTT(5 g·L-1)繼續培養 4 h,再加入DMSO(150 μL/孔),振蕩10 min后采用酶標儀(570 nm)測定吸光度(A)值。根據公式計算細胞生存率:細胞生存率=(實驗組A值/空白組A值)×100%。每組設3個平行孔,實驗重復3次。

1.5 Western blotting法檢測VEGF165b和VEGF165蛋白表達水平收集轉染48 h后各組HepG2細胞(分組同上),用PBS洗1次，按1×107個細胞加入100 μL預冷至4℃的裂解液,超聲粉碎細胞，低溫離心后取上清液-80℃凍存。為確保蛋白上樣量一致,樣品中蛋白經Bradford定量,然后加入2×SDS凝膠加樣緩沖液100℃煮沸變性,樣品中蛋白通過12%SDS-PAGE分離后轉至PVDF膜上,脫脂奶粉封閉4℃過夜；分別加入兔抗人VEGF165b、VEGF165和β-actin抗體(1∶500),4℃過夜；用TBST洗膜10 min,3次,加入1∶2 000稀釋的羊抗兔二抗,振搖1 h,TBST洗膜,DAB顯色,拍照。分析系統測定各條帶灰度值，計算蛋白表達水平。

1.6 細胞遷移實驗取對數生長期HepG2細胞調整細胞濃度至1×106L-1,Transwell小室內加入200 μL細胞懸液,分組同上。常規培養24 h后用0.1%結晶紫細胞染色，染色后可用33%醋酸脫色，將結晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標儀上570 nm處測其A值，間接反映細胞數，計算細胞遷移率。

2 結 果

2.1 各組HepG2細胞生存率空白組、對照組和PcDNA-VEGF165b組HepG2細胞生存率,24 h時分別為100.0%、(98.1±4.8)%和(96.9±3.7)%，48 h時分別為100.0%、(97.5±5.1)%和(93.1±4.3)%，72 h時分別為100.0%、(96.1±5.0)%和(91.8±4.9)%，各個時間點組間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組HepG2細胞中VEGF165b和VEGF165 mRNA表達水平與空白組(0.319±0.049和0.881±0.052)比較，對照組HepG2細胞中VEGF 165b和VEGF165 mRNA表達水平(0.401±0.055和0.798±0.049)無明顯變化(P>0.05)。與空白組比較，PcDNA-VEGF165b組VEGF165b mRNA表達水平(0.998±0.081)明顯升高(P<0.01)，VEGF165 mRNA表達水平(0.278±0.024)明顯降低 (P<0.01)。見圖1。

Lane 1:DNA marker；Lane 2： PcDNA-VEGF165b group；Lane 3：Control group；Lane 4：Blank group.

2.3 各組細胞中VEGF165b和VEGF165 蛋白表達水平與空白組(0.266±0.029和0.791±0.043)比較，對照組HepG2細胞中VEGF165b和VEGF165 蛋白表達水平(0.331±0.041和0.698±0.049)無明顯變化(P>0.05)。與空白組比較， PcDNA-VEGF165b組VEGF165b蛋白表達水平(0.969±0.081)明顯升高(P<0.01)，VEGF165蛋白表達水平(0.202±0.024)明顯降低 (P<0.01)。見圖2。

2.4 各組細胞遷移率與空白組(100.0%)比較，對照組HepG2細胞遷移率(98.1%±1.9%)無明顯變化(P>0.05)。與空白組和對照組比較，PcDNA-VEGF165b組HepG2細胞遷移率 (60.2%±9.1%)明顯降低(P<0.05)。

Lane 1： PcDNA-VEGF165b group；Lane 2：Control group；Lane 3：Blank group.

3 討 論

腫瘤的生長主要靠新生血管的生成，已經有大量研究[4]報道:肝癌組織中VEGF過度表達,且其過度表達與腫瘤的侵襲和轉移有密切關聯。VEGF有多種形式的剪接變異體：有促進血管生成的VEGFxxx 家族和抑制血管生成的VEGFxxxb家族[5]，在VEGFxxxb家族中，VEGF165b在功能和體內分布上都占有主導地位[6-7]。

VEGF165b可以抑制VEGF165介導的促進內皮細胞增殖、遷移和血管生成作用。VEGF165 通過激活血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)，促使細胞通過細胞外基質遷移和凋亡[8-9]。VEGF165b 和VEGF165 具有相同的VEGFR-2結合親和力，但VEGF165b 競爭性結合了VEGFR-2后可以抑制VEGFR-2激活，進而抑制VEGF165 介導的血管生成。研究[10]發現：VEGF165b在結腸直腸癌、腎癌、食管癌、前列腺癌和乳腺癌組織中的表達水平明顯低于正常組織，VEGF165b 表達下調可能成為判斷腫瘤預后的一個新指標[11]。

本課題組前期研究[12]顯示：肝癌組織中VEGF165b表達明顯低于正常肝組織,而肝癌組織中VEGF165表達明顯高于正常肝組織，表明VEGF165b與肝癌的發生和發展具有密切關系。本研究合成了外源性重組VEGF165b，成功轉染至肝癌細胞，通過PCR、Western blotting和MTT等方法探討其對肝癌細胞的作用。本研究結果顯示：成功轉染構建的PcDNA-VEGF165b 表達載體到HepG2細胞中，可以使VEGF165b mRNA和蛋白表達水平明顯增高，而VEGF165 mRNA和蛋白表達水平明顯降低。VEGF165b表達增高可以抑制HepG2細胞的遷移。本研究中MTT法檢測結果顯示：VEGF165b表達增高雖然可以使HepG2細胞的生存率有所降低，但與空白組比較差異無統計學意義。這與既往研究結果相似，但仍需大量實驗進一步驗證VEGF165b對HepG2細胞及其他腫瘤細胞增殖的影響。本課題組既往已經證明VEGF165b在正常肝組織中有大量的表達，而其在肝癌組織中表達較正常肝組織中明顯減少，且已證明VEGF165b對肝癌細胞有生長抑制作用。VEGF165b 可以抗血管生成和腫瘤轉移，從而發揮抑制腫瘤生長的作用[13]，可以通過提高表達VEGF165b、給予外源性重組VEGF165b 或促進VEGF 外顯子8b選擇性剪接[14-16]，從而達到治療腫瘤的目的。本研究為腫瘤的生物治療和靶向治療提供了實驗依據和數據。

綜上所述，VEGF165b對VEGF165有抑制作用，VEGF165b表達增加對肝癌細胞的侵襲具有抑制作用。VEGF165b有希望成為判斷肝癌預后的指標，并成為治療肝癌的靶向藥物。

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