三重靶向介導的Smac過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡和周期進程的影響

齊亞莉，劉 揚，梁 碩，龔守良，王志成，劉威武,3

(1.北華大學公共衛生學院流行病學教研室，吉林 吉林 132011；2. 吉林大學公共衛生學院 衛生部放射生物學重點實驗室,吉林 長春 130021; 3. 吉林大學第二醫院放射線科，吉林 長春 130041)

腫瘤基因-放射治療是治療乳腺癌的主要手段，具有廣闊的應用前景[1-2]。如何增強其治療靶向性非常重要，本文作者設想在腺病毒載體中加入人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)啟動子來增強腫瘤感染效率[3]，同時將缺氧反應元件(hypoxia-response element,HREs)克隆到腺病毒載體中增強乏氧條件下的感染效率[4-5]，早期生長因子(early growth response 1，Egr-1)啟動子克隆到靶基因上游增強靶基因的輻射靶向效果[6-7]，實現三重靶向介導凋亡誘導基因第二線粒體衍生的胱天蛋白酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)，增強腫瘤細胞凋亡性死亡的比率[8]。目前國內外尚未見相關的研究報道?；诖?，本研究探討三重靶向介導的Smac過表達作用于乳腺癌MDA-MB-231細胞后對細胞周期和凋亡的影響，為臨床乳腺癌放療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑、細胞系和儀器L15培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青公司產品，考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒購自南京建成生物設計院，HRE序列、內切酶和T4連接酶購自上海生工公司，氯化鈷(CoCl2)為美國Sigma公司產品，Smac和β-actin一抗及ECL發光液為美國Santa Cruz公司產品，辣根過氧化物酶標記的二抗為美國Pierce公司產品，Annexin Ⅴ-FITC試劑盒購自南京凱基生物公司。人乳腺癌MDA-MB-231細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所，人胚腎HEK293細胞由吉林大學公共衛生學院衛生部放射生物學重點實驗室保存。X射線深部治療機(Volcano,荷蘭Philips公司)

1.2 條件復制型腺病毒獲得質粒pShuttle-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K已經構建完成[9]，pMD19T-Smac質粒由郭彩霞博士惠贈，HRE序列(5′-TGTCACGTCCTGCACGAC-3′)兩端加入XhoⅠ和SmaⅤ酶切位點，將2條互補鏈進行合成。pMD19T-Smac質粒和pShuttle-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K質粒分別以XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，分別得到Smac片段和載體片段，利用T4 DNA連接酶進行連接，再將pShuttle-Egr1-Smac-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K質粒以XhoⅠ和SmaⅠ酶切，獲得載體片段，將HRE片段連接插入后獲得穿梭載體，經電轉化后并同源重組形成重組腺病毒質粒，利用脂質體2000試劑將其轉染到人胚腎HEK293細胞中，包裝好的條件復制型腺病毒命名為CRAd.pEgr-1-Smac (CRAd.pE-Smac)，以空病毒(CRAd.p)為對照。

1.3 實驗分組及細胞乏氧和照射處理本實驗設立對照組、CARd.pE-Smac組、乏氧組和CARd.pE-Smac +乏氧組，并根據是否進行4 Gy照射，每組又分為未照射組和照射組，共8個實驗組。MDA-MB-231細胞接種于6和24孔培養板中，細胞80%～90%融合后，以感染復數(multiplicity of infection,MOI)為5的病毒感染滴度進行細胞感染，以終濃度150 μmol·L-1CoCl2模擬乏氧，乏氧24 h后采用X射線深部治療機進行照射，劑量率為0.287 Gy·min-1。

1.4 Smac蛋白表達檢測病毒感染、乏氧和照射后12 h，MDA-MB-231細胞經裂解緩沖液RIPA提取總蛋白，考馬斯亮藍試劑盒進行蛋白定量。每泳道上樣50 μg總蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，硝酸纖維膜濕轉后5%脫脂奶粉封閉1 h，β-actin和Smac一抗4℃過夜孵育，TBST洗2次，辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育1 h。ECL發光液進行顯影，檢測表達量，并拍照進行分析。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率及不同周期細胞百分率采用AnnexinⅤ-FITC試劑盒(含有PI)雙染和單染，流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期百分率。按照每孔3×105個將MDA-MB-231細胞接種于24 孔培養板，染毒和乏氧后進行4 Gy的X射線照射，12 h后收集細胞，PBS洗2次，按照試劑盒說明書進行染色5～15 min后，上機檢測，每個樣品收取1.0×104個細胞。CellQuest軟件收集并分析數據，結果以細胞百分比表示。

2 結 果

2.1 各組MDA-MB-231細胞中Smac蛋白表達MDA-MB-231細胞經病毒感染、乏氧和4 Gy照射后6 h，CARd.pE-Smac組和CARd.pE-Smac + 乏氧組細胞中Smac蛋白表達水平增加，二者之間基本一致；而CARd.pE-Smac + 4 Gy組、乏氧+ 4 Gy組和CARd.pE-Smac +乏氧+ 4 Gy組中Smac蛋白表達水平逐漸增加，尤其以CARd.pE-Smac +乏氧+4 Gy組Smac蛋白表達水平最高。見圖1。

2.2 各組MDA-MB-231細胞凋亡率與對照組比較，其他各實驗組細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與相對應的未照射組比較，4 Gy照射后各實驗組細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，CARd.pE-Smac +乏氧+4 Gy組升高最為明顯。見表1和圖2。

圖1 Western blotting法檢測乏氧和4 Gy X射線照射后12 h MDA-MB-231細胞中Smac蛋白表達電泳圖

表1 乏氧和4 Gy照射后12 h 各組MDA-MB-231細胞凋亡率

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vsCARd.pE-Smac group;#P<0.05vshypoxia group;○P<0.01vsCARd.pE-Smac+hypoxia group.

2.3 各組MDA-MB-231細胞不同周期細胞百分率與對照組比較，CARd.pE-Smac +乏氧組和CARd.pE-Smac+乏氧+ 4 Gy組G0/G1期細胞百分率明顯降低(P<0.05)，而各組S期細胞百分率均明顯升高(P<0.05)，且乏氧+4 Gy組和CARd.pE-Smac +乏氧+4 Gy組S期細胞百分率與相對應的未照射組比較明顯升高(P<0.05)；除對照+4 Gy組外，其他各組G2/M期細胞百分率均較對照組明顯增加(P<0.05或P<0.01)，且CARd.pE-Smac +乏氧+4 Gy組較CARd.pE-Smac +乏氧組G2/M期細胞百分率明顯升高(P<0.05)。見表2。

3 討 論

目前，在腫瘤的基因-放射治療研究中，靶基因的選擇及其靶向性是治療效果能否增強的關鍵，提高靶向性及增強目標蛋白的表達，才能有效地實現基因治療和放射治療的雙重效應。將腺病毒載體進行基因結構的改變，使其增強對靶細胞的感染效率，最終實現靶細胞中級聯的擴大效應[10-11]。hTERT啟動子可介導腺病毒載體增強病毒對腫瘤的感染效率[3]，在本研究中利用hTERT啟動子介導條件復制型腺病毒載體。另外，相關文獻[6-7,12]證實：電離輻射能夠介導Egr-1啟動下游基因的表達，其根本原因是氧自由基作用于Egr-1的6個血清反應元件CarG從而發揮作用，而實體瘤內乏氧微環境導致輻射誘導自由基生成減少，影響Egr-1的效率，所以利用乏氧誘導因子反應原件HRE可介導乏氧條件下基因表達的效率[4-5]。在靶基因的選擇上，本研究將Smac作為候選基因，主要是利用了Smac由線粒體釋放入胞漿后，可以通過多種途徑引發caspase家族的級聯反應，進而促進細胞凋亡。另外，Smac與腫瘤關系密切，可在多種腫瘤組織中檢測到其表達[13]。研究[8]表明：過表達Smac基因能夠通過激活腫瘤細胞凋亡達到增強腫瘤細胞的放化療敏感性，增強治療效果。本研究中Western blotting法檢測結果顯示：輻射可以誘導乏氧條件下的乳腺癌MDA-MB-231細胞中Smac蛋白的高效表達，大大提高了靶向的效率。

A:Control group;B:CARd.pE-Smac group;C:Hypoxia group;D:CARd.pE-Smac+hypoxia group;E:Control+4 Gy irradiation group;F:CARd.pE-Smac+4 Gy irradiation group;G:Hypoxia+4 Gy irradiation group;H:CARd.pE-Smac+Hypoxia+4 Gy irradiation group.

表2 乏氧和4 Gy照射后6 h各組MDA-MB-231細胞中不同周期細胞百分率

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；△P<0.05vshypoxia group;#P<0.05vsCARd.pE-Smac+hypoxia group.

凋亡是細胞主動死亡的重要方式之一，放療時射線可以直接誘導凋亡，并且能夠導致細胞周期檢查點的阻滯，這是臨床腫瘤放射治療的基礎。用一定的基因治療策略啟動細胞凋亡從而有效地抑制腫瘤細胞的生長，對腫瘤放療有非常重要的意義[14]。Smac是一種促凋亡因子，近年來應用Smac進行抗腫瘤研究[15]表明：Smac高表達可以使腫瘤細胞凋亡，并增加腫瘤細胞放化療的敏感性。本研究結果表明：處于乏氧狀態的感染CARd.pE-Smac腺病毒的細胞，給予電離輻射則能誘導其凋亡，實現了腫瘤基因-放射治療目的的最大化。另外，細胞凋亡可發生在細胞周期不同的時相，細胞周期的進程與凋亡有關聯。本研究結果顯示：病毒、乏氧和輻射以及三者聯合均可明顯增加S期細胞和G2/M期細胞百分率，當細胞發生G2期阻滯，其細胞的DNA損傷有充分的時間完成修復，利于細胞存活，有利于提高腫瘤細胞放射治療效果[16]。本實驗導致MDA-MB-231細胞G2/M期阻滯，可能增加了細胞放射敏感性，有利于腫瘤放療。

綜上所述，本研究實現了腫瘤靶向性，利用了腫瘤的乏氧條件和輻射誘導啟動子的啟動效應，從而增強了目的基因Smac過表達，對于MDA-MB-231細胞發揮凋亡誘導作用并誘發G2/M期阻滯。本研究所設計的乳腺癌基因-放射治療綜合方案，既利用了腫瘤乏氧的不利條件來解決乏氧問題，也利用hTERT啟動子能夠增強目的基因腫瘤靶向性的作用進一步實現腫瘤細胞的靶向性，并且利用了Egr-1啟動子的輻射誘導特性，充分結合放療時有利和不利的情況實現基因放射治療的利益最大化。本研究為臨床乳腺癌的治療提供了新的思路。

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