銀杏二萜內酯類化合物拮抗PAF誘導的血小板聚集及對神經細胞的保護作用

徐君+王奎龍+曹澤彧+曹亮+王振中+蕭偉

[摘要] 該研究通過對銀杏二萜內酯類化合物拮抗PAF誘導的血小板凝集和神經保護作用進行檢測來探討銀杏內酯制劑治療缺血性腦卒中的作用機制。實驗以PAF作為血小板聚集誘導劑，將銀杏二萜內酯分別加入采集的兔血中，采用比濁法檢測各化合物對血小板凝集的抑制作用；在L-谷氨酸誘導的原代皮質神經細胞損傷模型上采用MTT檢測細胞活率，使用熒光染料Fura-2 AM檢測細胞內游離鈣離子濃度，通過Hoechst 33258染色法檢測銀杏二萜內酯對神經細胞凋亡的抑制作用。結果發現銀杏二萜內酯類化合物中抑制PAF誘導的血小板凝集活性大小依次為銀杏二萜內酯K（GK）、銀杏二萜內酯B（GB）、銀杏二萜內酯A（GA）、銀杏二萜內酯C（GC）、銀杏二萜內酯M（GM）、銀杏二萜內酯J（GJ）和銀杏二萜內酯L（GL）；其中GB和GK（1～100 μmol·L-1）能顯著減輕L-谷氨酸所致的細胞損傷，表現為神經細胞活率明顯提高（P<0.05），細胞內鈣離子濃度明顯下降（P<0.05）和細胞凋亡率明顯減少（P<0.05）。該研究明確了銀杏二萜內酯各化合物在抑制PAF誘導的血小板凝集和神經細胞保護方面的活性與作用特征。

[關鍵詞] 銀杏二萜內酯類化合物； 拮抗PAF受體； 神經保護； 凋亡； Ca2+超載

[Abstract] To study the antagonistic effect of ginkgolide homologues on platelet-activating factor （PAF）-induced platelet aggregation and investigate its neuroprotective effect. PAF was used as a coagulant， and ginkgolides were added to the rabbit blood samples respectively. The inhibitory effect of each compound on platelet aggregation was detected by turbidimetry. In L-glutamate induced primary cortical neuron cell injury model， MTT assay was used to detect cell viability. Intracellular free Ca2+ concentration in neurons was measured by using the fluorescent Ca2+ indicator Fura-2 AM. Morphological observation and Hoechst 33258 staining were used to detect the inhibitory effect of ginkgolide on neuronal apoptosis. The results showed that the inhibitory effect on PAF-induced platelet aggregation activity in ginkgolide homologues was ginkgolide K （GK）， ginkgolide B （GB）， ginkgolide A （GA）， ginkgolide C （GC）， ginkgolide M （GM）， ginkgolide J （GJ） and ginkgolide （GL） from high to low. GB and GK （1-100 μmol·L-1） could significantly reduce the cell damage caused by L-glutamate， with survival rate increasing， intracellular calcium concentration reducing and cell morphology restoring. This paper has identified the activities and characteristics of various compounds of ginkgolide homologues on PAF-induced platelet aggregation as well as its neuroprotective effect.

[Key words] ginkgolide homologues； antagonistic to PAF receptor； neuroprotection； apoptosis； Ca2+ overload

缺血性腦卒中是指腦部供血動脈狹窄或堵塞引發的腦組織局部供血、供氧、供糖等不足，進而導致腦組織壞死的一類疾病的總稱。缺血性腦卒中發生后，腦損傷組織內血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）水平上升和神經突觸過度分泌興奮性氨基酸如谷氨酸是導致病情繼續惡化的主要原因。高濃度PAF會引發炎癥和氧化應激[1]，而過量的興奮遞質會引起神經細胞凋亡和壞死[2]。目前缺血性腦卒中的主要治療方法有血壓、血糖、血氧控制相關的基礎治療，溶栓治療，抗凝血抗血小板治療和神經細胞保護治療[3]。其中抗凝血抗血小板藥物和神經保護藥物是治療缺血性腦卒中藥物開發的熱點。

銀杏萜內酯化合物是從銀杏葉中提取的結構相似有一定藥理活性的一類化合物，由倍半萜內酯和二萜內酯組成[4]，其中倍半萜內酯白果內酯被證明沒有明顯的抑制凝血功能，但有神經保護作用[5-6]，而二萜內酯類成分具有廣泛的藥理活性[7]。目前已經在銀杏葉中成功分離出到多種銀杏二萜內酯，它們分別是銀杏二萜內酯A（ginkgolide A，GA）、銀杏二萜內酯B（ginkgolide B，GB）、銀杏二萜內酯C（ginkgolide C，GC）、銀杏二萜內酯J（ginkgolide J，GJ）、銀杏二萜內酯K（ginkgolide K，GK）、銀杏二萜內酯L（ginkgolide L，GL）、銀杏二萜內酯M（ginkgolide M，GM）等，結構見圖1。endprint

GB是目前發現的最強的天然PAF受體拮抗劑之一，對心肌細胞和神經細胞具有顯著的保護作用，具有開發成抗血栓和治療心腦血管疾病的潛力[8]，但對于GB以外的二萜內酯化合物藥理活性報道較少，本文對銀杏二萜內酯類化合物拮抗PAF誘導的血小板凝集和神經保護作用進行研究和比較。

1 材料

LG-PABER-I 血小板聚集凝血因子分析儀（北京世帝科學儀器公司）；80-2臺式低速離心機[上海醫療器械（集團）有限公司手術器械廠]；Sartorius分析天平（北京多利斯天平有限公司）；CO2培養箱（Thermo Fisher Scientific公司），酶標儀（Bio-Rad公司）；RF-5000型熒光分光光度計（日本島津）。

枸櫞酸鈉、二甲基亞砜（DMSO），EGTA，Triton X-100，多聚甲醛購于南京化學試劑公司；鹽酸利多卡因購于上海朝暉藥業；PAF：Sigma公司，用生理鹽水配成10 mg·L-1； L-谷氨酸購于Sigma公司，用DMEM溶解至1.6 mmol·L-1并用NaOH 溶液調節pH 至7.0過濾除菌；GA，GB，GC，GJ和GK購于上海源葉生物公司；GL和GM由江蘇康緣藥業股份有限公司自行分離純化制備，用DMSO溶解；高糖DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購于Gibco公司；磷酸緩沖液（PBS）購于凱基生物公司；阿糖胞苷購于上海源葉生物公司；MTT（噻唑藍）、熒光染料Fura-2 AM購于Solarbiol公司；Hoechst 33258購于Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測試劑盒（13721800）購于Roche公司。

雄性家兔20只，體質量2.0～3.0 kg，購于南京市青龍山動物養殖場，許可證號SCXK（蘇）2012-008；SD乳鼠購于南京市青龍山動物養殖場，許可證號SCXK（蘇）2017-0001。

2 方法

2.1 富血小板血漿采集 取家兔2只，用利多卡因腹腔注射麻醉，手術分離頸總動脈取血，用3.8%枸櫞酸鈉溶液以1∶9抗凝，800 r·min-1離心10 min，取上清作為富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），剩余部分再以3 000 r·min-1離心10 min，取上清作為貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）[9]。

2.2 富血小板血漿處理 用PPP調節PRP的血小板濃度至360×109～400×109 個/L，通過比濁法進行血小板聚集實驗。在檢測管中加入260 μL PRP和不同濃度的受試藥物30 μL（1.5 μL DMSO和27.5 μL生理鹽水），室溫孵育5 min，加入10 μL PAF（終質量濃度為7 mg·L-1）作為誘導劑，觀察記錄5 min內最大聚集率[10-11]。用等量生理鹽水作為空白對照，同時用等量生理鹽水（含1.5 μL DMSO）作溶劑對照，計算各受試化合物不同濃度下的抑制率，并通過作抑制率-濃度標準曲線計算IC50。

抑制率=（對照組5 min內最大聚集率-待測樣品組5 min內最大聚集率）/（對照組5 min內最大聚集率）×100% （1）

2.3 原代小鼠腦皮質神經細胞分離[12]及培養 將新生SD乳鼠（24 h內）于-20 ℃冰箱冷凍10 min。75%乙醇消毒后斷頭取腦，在解剖液中仔細剝離腦膜，分離出皮層組織并用眼科剪剪成300～500 μm的腦片，轉移到裝有解剖液的小皿內，加入2.5%胰蛋白酶，37 ℃消化20 min。消化結束后將組織塊取出，用含10%血清的DMEM培養基終止消化，吹打均勻后過200目篩，細胞計數后用10%血清的DMEM培養基調整細胞濃度至1.0×109個/L。將神經細胞接種到用10 mg·L-1多聚賴氨酸溶液處理過的培養板中，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養。

接種24 h待細胞貼壁后換液，繼續培養48 h 后，加入阿糖胞苷使其終濃度為50 μmol·L-1以抑制非神經細胞生長，作用72 h后更換含10%血清的DMEM培養基繼續培養，經南京醫科大學病理研究室對原代細胞鑒定為原代皮質神經細胞，第8天用于神經細胞損傷模型實驗。

2.4 L-谷氨酸致原代皮層神經細胞損傷模型的建立及藥物處理 取培養至第8天的神經細胞棄去培養基，用PBS清洗2次后，在無血清DMEM培養基分別加入終濃度為1，10，100 μmol·L-1的銀杏二萜內酯化合物和終濃度為0.8 mmol·L-1的L-谷氨酸共同處理30 min后，換成無血清DMEM繼續培養24 h[13]。

2.5 MTT 法檢測細胞存活率 取原代大腦皮層神經以1×109個/L密度接種于96孔細胞培養板中，每孔接種100 μL，按上述條件培養8 d并按上述藥物處理方法處理細胞24 h后，每孔用PBS清洗2次，每孔加入100 μL含MTT濃度為0.5 g·L-1的DMEM培養基，37 ℃避光孵育4 h，棄去培養基，每孔加入200 μL DMSO，振蕩數5 min后采用酶標儀于570 nm處測吸光度。

細胞活率=（檢測組吸光度-空白培養基吸光度）/（空白組吸光度-空白培養基吸光度）×100% （2）

2.6 乳酸脫氫酶（LDH）漏出率的檢測 LDH是一種穩定的蛋白酶，存在于正常細胞的胞質中，正常情況下不能透過細胞膜，當細胞受到損傷時，細胞膜通透性增加，LDH即被釋放到細胞外。乳酸脫氫酶活性測定：按上述條件培養8 d并按上述藥物處理方法處理細胞24 h后，收集培養基上清100 μL，將剩余細胞加入裂解液處理，按照試劑盒說明書分別測定上清液LDH活性和細胞裂解液的LDH活性，根據公式計算每組LDH漏出率[14]。

LDH漏出率= 培養基上清液LDH活力單位 /（細胞裂解液LDH活力單位+培養基上清液LDH活力單位）×100% （3）endprint

2.7 Fura-2 AM雙波長熒光法測定細胞內鈣離子濃度[15] 神經細胞經藥物處理24 h后，用胰蛋白酶消化并收集細胞懸液，加入Fura-2 AM（終濃度為5 μmol·L-1）于37 ℃恒溫培養箱中振蕩30 min，2 000 r·min-1離心5 min，用Hanks 清洗2次后混懸。采用熒光分光光度計（RF-5000型，日本島津）進行熒光測定，Fura-2及其與Ca2+結合后的復合物的最大激發波長分別為380，340 nm，發射波長為500 nm，這種變化可指示Ca2+的存在及其濃度。

其中，R是實驗中觀察到的熒光比值（F340/F380）；37 ℃時Kd為224 nmol·L-1；Rmax為神經細胞加入0.09% Triton X-100透化后測得的F340/F380，Fs為神經細胞加入0.09% Triton X-100透化后在380 nm激發光下測得的Fura-2熒光強度（F380），Rmin為神經細胞加入Triton X-100 透化后再加入EGTA（終濃度為3 mmol·L-1）的F340/F380，F0為神經細胞加入Triton X-100透化后再加入EGTA后在380 nm激發光下測得的熒光強度（F380）。

2.8 Hoechst 33258 熒光染色 熒光染料Hoechst能與DNA雙鏈中的小溝結合，能夠對細胞核進行標記，當細胞發生凋亡時，染色質會發生固縮，細胞核呈致密濃染，經過Hoechst染色后，正常細胞的細胞核呈正常的藍色，而凋亡細胞呈現出亮藍色[16]。取藥物處理細胞和正常培養細胞，吸去培養基后，用4 ℃預冷的PBS 洗3 次，加入4 ℃預冷的體積比為4%的多聚甲醛溶液（用PBS溶解）于室溫固定30 min，然后用4 ℃預冷的PBS洗滌3次，加入Hoechst 33258至終濃度為2.5 mg·L-1，并于室溫避光染色5 min。染色結束用PBS 清洗3 次，熒光顯微鏡下觀察細胞核形態并拍照，同時對視野內的正常細胞和凋亡細胞進行計數并計算細胞凋亡率[17]。

2.9 數據處理 實驗數據以±s表示；組間比較采用One way-ANOVA檢驗。

3 結果

3.1 銀杏二萜內酯類化合物對PAF誘導的血小板凝集的影響 在體外實驗中發現生理鹽水組和溶劑對照組最大聚集率分別為（65.24±4.21）%，（63.58±3.53）%，各銀杏二萜內酯化合物對PAF誘導家兔血小板聚集均有一定作用，并且呈量效關系，IC50見表1，其中GB和GK活性最強，其IC50分別為0.57，0.31 μmol·L-1，GJ，GL和GM活性較弱，IC50分別為31.5，45.5，21.0 μmol·L-1。

3.2 銀杏二萜內酯類化合物對谷氨酸誘導的神經細胞活性的影響 原代乳鼠腦皮質神經細胞經過分離培養后，對谷氨酸的造模劑量進行研究后，發現劑量在0.8 mmol·L-1誘導細胞發生凋亡最為合適。原代神經經L-谷氨酸（0.8 mmol·L-1）處理后，細胞活率明顯低于對照組，約為空白組55%。不同濃度的銀杏二萜內酯和谷氨酸共同處理細胞30 min， 換液繼續培養24 h后檢測發現GA，GB和GK對細胞的保護最為明顯，在100 μmol·L-1的濃度下，細胞活率達到了空白組的75.3%，89.2%，91.3%，見表2。

3.3 銀杏二萜內酯類化合物對谷氨酸誘導神經細胞乳酸脫氫酶（LDH）漏出的影響 LDH主要分布于活細胞的胞漿內，正常情況下，LDH不能透過細胞膜，當細胞受到損傷后，LDH被釋放到細胞外，因此可以利用LDH釋放率來判斷細胞的損傷程度，見圖2。經L-谷氨酸處理的模型組細胞LDH漏出率明顯升高，銀杏二萜內酯同系物對L-谷氨酸誘導的乳酸脫氫酶泄漏都有一定的影響，其中GA，GB，GK對細胞的保護最為明顯，表明這3種化合物對L-谷氨酸誘導的細胞損傷具有一定的保護作用。

3.4 銀杏二萜內酯類化合物對L-谷氨酸誘導神經細胞凋亡時細胞內[Ca2+]i的影響 在缺血性損傷中，神經細胞內Ca2+濃度升高并引發病理反應是導致神經細胞死亡的原因之一，有研究發現GB在神經細胞興奮毒性情況下能抑制Ca2+內流，從而保護神經[13]，見表3。本實驗通過Fura-2 AM 雙波長熒光法對神經細胞胞內的Ca2+進行檢測，結果發現空白組神經細胞胞內離子濃度較低，L-谷氨酸處理后，胞內離子濃度約為空白組的2倍，化合物GA，GB，GC，GK（1～100 μmol·L-1）處理后，神經細胞內Ca2+濃度都有劑量依賴性的降低，其中GB和GK抑制效果顯著。

3.5 銀杏二萜內酯類化合物對谷氨酸誘導神經細胞凋亡的影響 采用Hoechst 33258 染色后可見正常神經細胞胞核顏色均勻分散呈深藍色，用0.8 mmol·L-1 L-谷氨酸處理后，模型組細胞核大小不一，部分細胞核發生皺縮，同時伴有染色質凝聚及核碎片出現，顏色為亮藍色。GA，GB，GC，GJ，GK，GL（10 μmol·L-1）處理細胞后與模型組相比，視野內細胞凋亡率都有一定程度的降低，見表4，其中GA，GB，GK抗凋亡效果明顯，視野內亮藍色凋亡細胞顯著減少，正常細胞數目較多，見圖3。

4 討論

PAF是在1972年由Bemrniste等[18]發現的一種具有生物活性的脂質分子，研究發現PAF在體內 具有類似于激素的生物活性，能作用于多種組織和細胞，除了能夠促進血小板活化和血栓形成，還有研究表明過量的PAF可以導致神經炎癥和血管通透性增加。

研究發現GB是一類天然的PAF受體拮抗劑，GB治療腦缺血的機制主要有包括抗血小板聚集，抑制神經細胞凋亡，抗炎癥，抗氧化等[19]。本實驗通過對銀杏二萜內酯類化合物拮抗PAF受體的活性進行研究，其中體外血小板聚集實驗結果表明，抑制血小板聚集（PAF）能力大小依次為GK，GB，GA，GC，GM，GJ，GL，實驗表明銀杏二萜內酯類化合物對PAF受體具有拮抗作用，不僅可以抑制血栓形成，還可以抑制PAF過度釋放導致的神經炎癥、細胞凋亡、氧化損傷、血管通透性增加。同時也發現雖然各二萜類內酯化合物都具有相似的結構，但活性強弱明顯不同，可能與它們與受體結合能力的強弱有關。endprint

谷氨酸是由神經細胞突觸分泌一種興奮性神經遞質，但在腦卒中、腦外傷等情況下，腦神經細胞外液谷氨酸濃度過高，強烈刺激谷氨酸受體引起神經細胞損傷和死亡。本實驗中用0.8 mmol·L-1 L-谷氨酸處理原代皮質神經元后發現細胞損傷明顯，細胞活力顯著降低，乳酸脫氫酶泄漏明顯，細胞內鈣離子濃度升高。而銀杏二萜內酯類化合物均具有不同程度的保護作用，其中GB和GK對神經細胞的保護作用明顯，尤以GK為佳，Hoechst 33258染色檢測結果顯示L-谷氨酸主要機制是誘導凋亡，而GB，GK能顯著抑制谷氨酸導致的凋亡。

本文通過對銀杏二萜內酯類化合物體外血小板聚集抑制和神經保護作用的研究，明確各化合物作用效果。該結果表明，銀杏二萜內酯是銀杏類制劑治療腦卒中的有效成分，其中以GA，GB，GK活性較強，能夠從抑制血小板聚集和神經保護兩方面來治療腦卒中。

[參考文獻]

[1] 李泓. 花生四烯酸代謝、血小板激活因子、血小板膜蛋白與腦缺血 [J]. 國外醫學·神經病學神經外科學分冊， 1996 （2）： 80.

[2] Castillo J，Davaios A，Nareiro J，et al. Neuroexcitatory amino acids and their relation to infarct size and neurological deficit in ischemic stroke [J]. Stroke， 1996， 27（6）： 1060.

[3] 林暉. 急性缺血性腦卒中的發病機制及治療進展 [J]. 內科， 2012， 7（5）： 540.

[4] 惠愛玲， 吳澤宇， 袁媛， 等. 銀杏內酯衍生物和類似物的合成及PAFR和GlyR拮抗活性研究進展 [J]. 有機化學， 2013， 33（6）： 1263.

[5] Bruno C， Cuppini R， Sartini S， et al. Regeneration of mator nerves in bilobalide-treated rats [J]. Planta Med， 1993， 59（4）： 302.

[6] Wang Q J， Wu X F， Liu W T. Effects of ginkgolides on imitational anemic anoxic injures and secondary apoptosis of PC12 cells in vitro [J]. Chin J Nat Med， 2003， 1（4）： 213.

[7] Braquet P. The ginkgolides： potent platelet-activating factor antagonists isolated from Ginkgo biloba L.： chemistry， pharmacology and clinical applications [J]. Drugs Future， 1987， 12（7）： 643.

[8] 周春華， 盛艷樂， 趙大球， 等. 銀杏萜內酯的生物合成研究進展 [J]. 中藥材， 2009， 32（6）： 994.

[9] 劉成鼎， 潘蘇華， 毛黎順， 等. 銀杏內酯B衍生物抗血小板聚集作用和作用機制 [J]. 中國天然藥物， 2009， 7（4）： 301.

[10] 張愛林，徐秋萍，孫建寧，等.復方銀杏滴丸抗血栓及抑制血小板聚集作用實驗研究[J]. 北京中醫藥大學學報，2004，27（1）：42.

[11] Jiang M， Bian H M. Inhibitory effects of Ginkgo bilobalide on platelet aggregation in rabbits [J]. J Nanjing Univ Tradit Chin Med， 2008， 24（3）： 197.

[12] Sasaki Y， Fukushima N， Yoshida A， et al. Low-density induced apoptosis of cortical neurons is inhibited by serum factors [J]. Cell Mol Neurobiol， 1998， 18（5）：487.

[13] 蔡衛斌， 臧穎， 余明華. 銀杏內酯B對谷氨酸誘導大鼠大腦皮質神經元氧化損傷的影響 [J]. 中山大學學報：醫學科學版， 2003， 24（3）： 256.

[14] 黃賤英. 銀杏內酯B抗腦缺血作用及機制研究 [D]. 北京：北京中醫藥大學， 2005.

[15] 宋穎，李塵遠，張孟姝，等.銀杏內酯B對谷氨酸誘導SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用 [J].中藥藥理與臨床， 2015（5）：23.

[16] Fiedorowicz A， Figiel I， Kaminska B， et al. Dentate granule neuron apoptosis and glia activation in murine hippocampus induced by trimethyltin exposure [J]. Brain Res， 2001， 912（2）： 116.

[17] 佟彤， 尚菊菊， 解欣然，等. 心衰合劑對肥大心肌細胞凋亡及乳酸脫氫酶漏出率的影響 [J]. 中華中醫藥雜志， 2013（10）： 3086.

[18] Benveniste J， Boullet C， Brink C， et al. The actions of Paf-acether （platelet-activating factor） on guinea-pig isolated heart preparations [J]. British J Pharmacol， 1983， 80（1）： 81.

[19] 高晉生， 李囿松. 銀杏內酯B的藥理作用研究進展 [J]. 黑龍江中醫藥， 2011， 40（6）： 62.

[責任編輯 孔晶晶]endprint