何首烏中THSG和蒽醌類成分對人孕烷X受體介導的CYP3A4的調控作用

張照研+楊亮+黃小燕+汪美汐+馬增春+湯響林+王宇光+高月

[摘要] 該文探討何首烏主要化學成分2，3，5，4′-四羥基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside，THSG）、蒽醌類（大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚）對人孕烷X受體（human pregnant X receptor，PXR）介導的CYP3A4的轉錄調控作用。利用前期建立的PXR介導的CYP3A4藥物誘導快速篩選技術，采用MTS細胞檢測方法考察何首烏中主要化學成分對細胞活性的影響，計算IC50；利用雙熒光素酶報告基因系統，將PXR表達載體和含CYP3A4轉錄調控區的報告基因載體共轉染HepG2細胞，10 μmol·L-1利福平（RIF）為陽性對照，10 μmol·L–1酮康唑（TKZ）為陰性對照，用THSG（2.5，5，10 μmol·L-1）和蒽醌類成分（2.5，5，10 μmol·L-1）分別處理24 h，進行雙熒光素酶活性檢測。結果表明，空載質粒pcDNA3.1與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，THSG、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素對CYP3A4的調控多為抑制效應，大黃素對CYP3A4產生誘導作用；pcDNA3.14-PXR與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，THSG、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素均產生誘導效應。綜上，THSG和蒽醌類成分均可對CYP3A4產生抑制或激活效應，PXR參與后，上述成分對CYP3A4均產生誘導效應，提示何首烏中主要成分對CYP3A4的誘導作用是通過PXR實現的。以上結果提示在與何首烏聯合用藥時應注意潛在的藥物相互作用，提高中藥的安全性和有效性。

[關鍵詞] 何首烏； THSG； 蒽醌類成分； 人孕烷X受體； 細胞色素P450 3A4

[Abstract] The rapid screening technology was used to investigate the transcriptional regulation effect of main chemical constituents in tubers of Polygonum multiflorum， including 2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside（THSG） and anthraquinones （such as rhein， chrysophanol， aloe-emodin， emodin） on CYP3A4 drug inducers induced by human pregnancy X receptor （PXR）.The effect of chemical composition on the cell activity was detected by MTS cell viability assay. IC50 was calculated. The expression vector and the reporter vector were co-transfected into HepG2 cells， with 10 μmol·L-1 rifampicin （RIF） as a positive control， and 10 μmol·L-1 ketoconazole （TKZ） as a negative control. After treated with different concentrations of anthraquinones （2.5， 5， 10 μmol·L-1） for 24 h， the cells were tested for dual luciferase activity. The results show that the inhibitory effect of THSG， chrysophanol， emodin， rhein and aloe-emodin on CYP3A4 was inhibited by co-transfection of pcDNA3.1 and pGL4.17-CYP3A4. The expressions of pcDNA3.14-PXR and pGL4.17-CYP3A4 were induced by the four compounds. Besides， emodin had a direct inducing effect. In conclusion， the four anthraquinone compounds have an inducing effect on CYP3A4 by PXR， but emodin can directly induce CYP3A4. THSG can inhibit CYP3A4， but plasmid can induce CYP3A4 after intervened with PXR.These results suggest that we should pay attention to the liver function and avoid liver damage in the combined administration of drugs.

[Key words] Polygonum multiflorum； THSG； anthraquinones； human progesterone X receptor （PXR）； CYP3A4

中藥何首烏是蓼科蓼族何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的塊根。生何首烏可安神、養血、活絡、解毒（截瘧）、消癰；制何首烏具有補益精血、烏須發、強筋骨、補肝腎之功效。何首烏的主要化學成分有二苯乙烯苷類、蒽醌類、鞣質類、聚合花青素類、卵磷脂類等[1]。藥理學研究顯示，何首烏在治療肝病方面應用廣泛，在治療非酒精性脂肪肝、肝硬化、肝纖維化、乙肝、肝癌等方面具有較好效果。endprint

隨著中草藥廣泛應用和不良反應監測體系不斷完善，中草藥相關性肝損傷（herb-induce liver injury，HILI）報道呈升高趨勢[2]。中草藥相關性肝損傷在藥物導致肝損傷（drug-induce liver injury，DILI）中占一定比例，原因具有復雜性。研究表明，何首烏可用于肝臟疾病的治療，對特定人群卻能導致肝臟的損傷[3]。近些年來，何首烏及其制劑和保健品導致肝損傷的報道呈上升趨勢[4-5]。2013年10月，CFDA發布5種含何首烏藥物對特定人群禁用的通告。2014年7月，藥品不良反應信息（第61期）通報口服何首烏及其成方制劑可能有引起肝損傷的風險。2014年7月和9月，CFDA發布何首烏保健食品監管和含何首烏保健食品成分變更的通知。臨床上報道中草藥肝損害的案例中，何首烏的病例為第1位，為藥物性肝損傷的第15位[6]。因此研究何首烏致肝損傷作用機制對于指導何首烏臨床合理使用尤為重要。本文主要觀察何首烏中主要化學成分二苯乙烯苷類的2，3，5，4′-四羥基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucopyranoside，THSG）和蒽醌類成分對藥物代謝酶CYP3A4的影響，探究CYP3A4的主要調控因子孕烷X受體是否參與何首烏主要化學成分對CYP3A4的轉錄調控作用，以期為何首烏致肝毒性作用機制提供實驗依據，為臨床指導使用何首烏及其聯合用藥提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 3110細胞培養箱（Thermo公司）；Microfuge 22R臺式高速離心機（Beckman公司）；Axiovert 40倒置顯微鏡（ZEISS公司）；VICTOR X多標記酶標儀 （Perkin Elmer公司）。

1.2 藥物與試劑 THSG（CAS：82373-94-2，Lot：F210036），大黃酸（CAS： 478-43-3，Lot：F522425），大黃酚（CAS： 481-74-3，Lot：F249787），大黃素甲醚（CAS：521-61-29，Lot：F465584），蘆薈大黃素（CAS： 481-72-1，Lot：F060344），均購買于上海一飛生物科技有限公司，純度均大于98%，見圖1；利福平（CAS：13292-46-1，Cat No.：S1764，Lot.01），酮康唑（CAS：65277-42-1，Batch No.：14239）購于Selleck公司，以上成分均用DMSO溶解制備10 mmol·L-1母液，-20 ℃保存備用。DMEM培養基（美國Gibco公司，Lot：1621440），Gibco胎牛血清（FBS；Thermo Fisher Scientific公司，Lot：505985），胰蛋白酶（Sigma公司，批號E23AT050），青霉素鏈霉素雙抗溶液（HyClone公司，Lot：J170012），MTS（Promega公司，Lot：0000171446）。lipofectamine 2000（ThermoFisher公司，Lot：1815568）。

1.3 細胞和質粒 HepG2細胞均購于中國醫學科學院基礎醫學研究所，由本實驗室凍存保種。完全培養基由10%FBS，100 mg·L-1青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養基構成。細胞在37 ℃，5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中培養，0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。質粒pGL-4.17-CYP3A4，pcDNA3.14-PXR由實驗室構建并保存，空載質粒pcDNA3.14-vector、內參質粒pLR-TK購于美 國Promega公司。

1.4 MTS法檢測細胞存活率 對數期的HepG2細胞經胰酶消化，接種于96孔板，待細胞密度達到80%時，吸棄培養液，用磷酸緩沖液（PBS）洗滌1次，換成分別含有不同濃度藥物成分的含2%血清但不含雙抗的DMEM培養基，培養24 h；吸棄含藥培養基，每孔加入20 μL MTT，孵育1 h，在595 nm處用酶標儀測定吸光度。每組設3副孔，細胞的活性按以下公式計算：細胞活性=[（用藥組-空白組）/（對照組-空白組）]×100%，用GraphPad Prism計算半數抑制濃度（IC50）。

1.5 藥物處理和熒光素酶活性檢測 按照轉染試劑 lipofectamine 2000說明書操作，取對數生長期 HepG2細胞，胰酶消化，細胞計數，按照每孔2.5×105細胞接種于24孔板中，當細胞密度達到約80%時，用Opti-MEM培養液稀釋質粒。500 ng pcDNA3.1-hPXR，250 ng pGL4.17-CYP3A4以及50 ng pRL-TK內參質粒，2 μL lipofectamine 2000混勻，室溫孵育20 min，每孔加入100 μL混合轉染液，放細胞培養箱中培養。轉染6 h，吸去混合液，加入含有不同濃度藥物的含2%血清不含雙抗的DMEM培養基，設置10 μmol·L-1利福平（RIF）給藥孔作為陽性對照組，10 μmol·L-1酮康唑（TKZ）給藥孔作為陰性對照組，每組分別設3個副孔。放入37 ℃，5%CO2的恒溫培養箱中培養24 h，吸去各組培養液，用PBS洗滌細胞1次，每孔中加入100 μL 1×PLB溶液，室溫下靜止裂解15 min后，加入100 μL LABⅡ溶液，用多功能酶標儀檢測各孔的螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase）活性；緊接著各孔加入100 μL Stop&Glo試劑，啟動海腎螢光素酶反應后，對海腎熒光素（renilla luciferase）熒光活性進行檢測，并計算熒光值比值。

1.6 統計學分析 實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，多組數據間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗處理，P<0.05表示有統計學意義。endprint

2 結果

2.1 THSG和蒽醌類成分對細胞存活率的影響 THSG在較高濃度下對細胞增殖有抑制作用，見圖2A，經計算THSG的IC50為366.9 μmol·L-1。

2.2 大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素對細胞存活率的影響 蒽醌類成分對細胞存活率的影響見圖2B～圖2F。各成分給藥濃度分別為2.5，5，10 μmol·L-1時，經GraphPad Prism計算，大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素的IC50分別為9.46，19.29，13.95，26.06，13.65 μmol·L-1。

2.3 THSG對PXR介導的CYP3A4的轉錄調節作用 結果見圖3A。與對照組比較，RIF組CYP3A4熒光素酶活性顯著增強（P<0.001），表明hPXR-CYP3A4熒光素酶報告基因體系響應正常?？蛰d體pcDNA3.1與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，THSG給藥組對CYP3A4的表達分別是對照組的（0.63±0.08）倍（P<0.01），（0.52±0.09）倍（P<0.01），（0.69±0.14）倍（P<0.001），均具有顯著性抑制作用；當pcDNA3.14-PXR與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，THSG明顯增加CYP3A4活性的表達，和空載質粒pcDNA3.1與CYP3A4質粒共轉染相比較，均有顯著性統計學差異（P<0.01），表明PXR參與THSG對CYP3A4的表達調控。

2.4 蒽醌類成分對PXR介導的CYP3A4的轉錄調節作用 大黃素：結果見圖3B?？蛰d體pcDNA3.1與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，大黃素給藥組對CYP3A4的誘導表達分別是對照組的（1.42±0.23）倍（P<0.05），（1.75±0.10）倍（P<0.001），（2.51±0.11）倍（P<0.001），具有顯著性誘導作用；當pcDNA3.14-PXR與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，大黃素對CYP3A4的表達活性顯著增強，和空載質粒pcDNA3.1與CYP3A4質粒共轉染相比較，僅有10 μmol·L-1的大黃素給藥組對CYP3A4的誘導倍數具有統計學差異（P<0.05）。研究結果提示大黃素對CYP3A4具有直接誘導作用，體外轉染的PXR一定程度上增強大黃素對CYP3A4的誘導作用。

大黃酚：結果見圖3C?？蛰d體pcDNA3.1與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，大黃酚給藥組CYP3A4的活性分別是對照組的（0.92±0.01）倍（P<0.05），（0.78±0.04）倍（P<0.01），（0.70±0.03）倍（P<0.001），具有顯著性抑制作用；當pcDNA3.14-PXR與pGL4.17-CYP3A4 共轉染時，給藥組CYP3A4的活性分別是對照組的（1.03±0.02）倍，（1.10±0.04）倍（P<0.05），（1.10±0.03）倍，結果顯示，2.5，10 μmol·L-1給藥組有微弱誘導作用，無統計學意義。大黃酚對CYP3A4有微弱誘導作用。

大黃酸：結果見圖3D?？蛰d體pcDNA3.1與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，大黃酸給藥組CYP3A4的活性分別是對照組的（0.71±0.02）倍（P<0.001），（0.62±0.04）倍（P<0.001），（0.76±0.01）倍（P<0.01），具有顯著性抑制作用；當pcDNA3.14-PXR與pGL4.17-CYP3A4 共轉染時，給藥組CYP3A4的活性分別是對照組的（1.56±0.07）倍（P<0.001），（1.47±0.12）倍（P<0.001），（1.29±0.06）倍（P<0.001）。pcDNA3.14-PXR質粒與CYP3A4質粒共轉染時CYP3A4的熒光倍數分別為空載質粒pcDNA3.1與CYP3A4質粒共轉染時的（2.22±0.18）倍（P<0.01），（2.22±0.17）倍（P<0.01），（1.70±0.08）倍（P<0.01）。以上結果表明，大黃酸能通過調控因子PXR誘導CYP3A4的表達。

大黃素甲醚：結果見圖3E?？蛰d體pcDNA3.1與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，大黃素甲醚給藥組CYP3A4的活性分別是對照組的（0.63±0.08）倍（P<0.01），（0.52±0.09）倍（P<0.01），（0.68±0.01）倍（P<0.001），具有顯著性抑制作用；當pcDNA3.14-PXR與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，給藥組CYP3A4的活性分別是對照組的（1.21±0.04）倍（P<0.001），（1.21±0.06）倍（P<0.001），（1.05±0.04）倍（P<0.01）。pcDNA3.14-PXR質粒與CYP3A4質粒共轉染時CYP3A4的熒光倍數分別為空載質粒pcDNA3.1與CYP3A4質粒共轉染時的（1.71±0.21）倍（P<0.01），（2.09±0.21）倍（P<0.01），（1.54±0.03）倍（P<0.01）。以上結果表明，大黃素甲醚能通過PXR誘導CYP3A4的表達。

蘆薈大黃素：結果見圖3F?？蛰d體pcDNA3.1與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，蘆薈大黃素給藥組CYP3A4的活性分別是對照組的（0.60±0.04）倍（P<0.001），（0.68±0.04）倍（P<0.001），（1.27±0.08）倍（P<0.01），3個給藥組中，2.5，5 μmol·L-1具有顯著性抑制作用，10 μmol·L-1給藥組有顯著誘導作用；當pcDNA3.14-PXR與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，給藥組CYP3A4基因的表達分別是對照組的（1.40±0.05）倍（P<0.001），（1.19±0.11）倍，（1.56±0.14）倍（P<0.01）。pcDNA3.14-PXR質粒與CYP3A4質粒共轉染時CYP3A4的誘導活性分別為空載質粒pcDNA3.1與CYP3A4質粒共轉染時的（2.35±0.22）倍（P<0.01），（1.65±0.24）倍（P<0.05），（1.72±0.03）倍。以上結果表明，蘆薈大黃素2.5，5 μmol·L-1給藥濃度下能通過PXR誘導CYP3A4的表達，10 μmol·L-1給藥組能直接產生直接誘導效應。endprint

3 討論

中藥致肝損傷與其在肝臟代謝過程密切相關[7]。中藥作為外源性物質，其主要化學成分在肝臟以細胞色素P450為核心的單加氧酶系的作用下，進行氧化、還原等一系列反應，最終轉化為極性化合物排出體外。長期服用中藥可能對肝臟的藥物代謝酶產生影響，進而影響其他藥物的代謝，藥物相互作用能使毒性增強和不良反應產生。CYP3A4是細胞色素 P450超家族的主要成員，負責代謝50%以上的臨床藥物，對藥物的吸收、代謝、排泄有重要的作用[8-9]。PXR作為調控因子，在CYP3A4的表達中起到主要調控作用[10-13]。許多藥物能活化PXR，間接影響CYP3A4的表達[14-16]?；谇捌诮⒌乃幬锎x酶體外篩選平臺，通過對中藥成分的篩選分析，實驗室得到一批具有潛在CYP450誘導和抑制能力的化合物，并對產生誘導或抑制作用機制進行探討，這些研究對于闡明中藥復方組分配伍減毒增效的特點和規律具有十分重要的價值[14，17]。研究藥物對PXR介導的CYP3A4的轉錄調節作用有重要的意義。

何首烏對肝臟的作用具有“有故無殞”現象，表現為高劑量何首烏可導致正常動物肝損傷，對于慢性肝損傷模型動物卻具有肝保護和治療作用[18]。目前的研究主要關注何首烏炮制前后導致毒性[19-20]、血清代謝組學[21]和尿液代謝組學[22-24]的差異；特異質動物模型評價生、制何首烏的肝損傷[25-26]；單體成分對Ⅰ相和對Ⅱ相代謝酶影響的研究[27-28]等方面。以何首烏肝損傷為例，王伽伯等[29]構建基于整合證據鏈的中藥肝毒性客觀辨識的策略和方法，并從易感人群篩查、炮制減毒、配伍減毒及辨證用藥減毒等關乎臨床合理用藥的問題進行系統分析，為科學評價中藥肝損傷風險、構建合理用藥保障技術體系提供研究思路和方法學參考。本實驗室在何首烏肝損傷方面做了一些原創性研究，李丹丹[30-31]通過建立3D肝毒性評價模型并對何首烏肝毒性機制進行探索，發現生何首烏與制何首烏均能引起模型氧化應激和內質網應激反應，通過降低線粒體膜電位對線粒體功能造成損傷。生首烏的毒性早期主要由氧化應激引起，后期包括內質網應激；制首烏的毒性早期主要由內質網應激引起，后期伴有一定的氧化應激的現象。近期研究報道，李婷婷等[32]采用液滴重疊法成功構建類器官3D培養模型，并評價何首烏中有效成分順式THSG的肝損傷作用，發現何首烏易感物質順式THSG對3D器官模型的肝毒性大于反式THSG，提示長期用藥可能增大何首烏肝損傷風險。

何首烏中THSG和蒽醌類成分會導致肝損傷[33-35]?；趯嶒炇蚁惹皹嫿ǖ腃YP3A4質粒和PXR質粒，本研究利用雙熒光素酶報告基因法，采用目的基因與調控基因質粒共轉染HepG2細胞，發現空載質粒pcDNA3.1與pGL4.17-CYP3A4共轉染時，THSG、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸均對CYP3A4有抑制作用，調控基因質粒pcDNA3.14-PXR與pGL4.17-CYP3A4共轉染時THSG、大黃素甲醚、大黃酸產生誘導效應；大黃素對CYP3A4有直接誘導作用。上述結果表明何首烏中的成分（二苯乙烯苷類和蒽醌類）能夠通過PXR對CYP3A4產生調節作用，聯合用藥時應注意潛在肝損傷風險，在臨床使用時應密切監測肝功能的變化，避免產生肝損傷。

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[責任編輯 張寧寧]endprint