影響牛體外胚胎生產效率的因素

王 娜 ，李 姣 ，王小武 ，郭 晶 ，趙明禮 ，郝少強 ，郭春明 ，馬 毅

（1.天津中科博雅生物育種研究有限公司 300457；2.全國畜牧總站 100125；3.天津市畜牧獸醫研究所 300384）

在牛繁殖領域，大量進行體外胚胎生產已有近30年的歷史，但這主要作為研究手段，一方面用來了解體內胚胎正常發育的過程，另一方面作為其他生物技術（如轉基因、克隆等）的研究材料[1]。然而近年來，牛體外胚胎生產技術越來越得到眾多科研人員的重視，也取得了顯著性的研究成果。國外一些發達國家已成功將該技術應用于牛生產實踐，而我國仍停留在實驗室研究階段，盡管有將體外受精胚胎進行移植并順利妊娠產下犢牛的報道，但仍處于初期探索階段[2]。因此，為加快我國牛良種繁育進程和擺脫人們日益對進口牛類畜產品的依賴，現階段亟需將該技術與胚胎移植、活體采卵（OPU）技術相結合，應用于生產實踐，推廣應用。

與體內胚胎相比，體外胚胎移植后的妊娠率顯著低于體內胚胎移植后的結果，其根源在于體外胚胎移植后建立和維持妊娠的能力，這也是限制體外胚胎用于生產實踐的關鍵因素[3-4]。牛體外胚胎生產主要由卵母細胞體外成熟（IVM）、體外受精、胚胎體外培養等三個關鍵步驟組成，這三個步驟的順利進行與胚胎移植后的存活及成功妊娠密切相關。因此，本文總結了上述三個環節中影響胚胎產量和質量的因素，以期為后續體外胚胎生產技術的優化研究和推廣應用提供參考。

1 卵母細胞體外成熟

1.1 卵母細胞來源

胚胎的大部分遺傳物質來源于卵母細胞，因此，卵母細胞的發育潛力直接影響體外受精和囊胚形成效率，所以，在一定程度上胚胎的發育潛力在受精時就已經被決定了[3]。卵母細胞發育潛力也稱卵母細胞質量，研究表明，卵母細胞來源對卵母細胞質量有顯著影響，不同來源的卵母細胞，其質量差別也較大[1]。未成熟卵母細胞的來源主要有兩種途徑，一是從屠宰場卵巢中獲取，利用切割或抽吸法獲取卵巢表面2～8mm卵泡內的卵丘—卵母細胞復合體（COCs）進行體外成熟[5]。該方法取材容易、成本低，但很難確定卵母細胞的系譜，常用于體外胚胎生產技術體系的優化研究。二是OPU，即借助B超引導、真空泵抽吸的方式，通過陰道穹隆進行卵巢穿刺采卵。該方法需要一定的操作技巧，對技術人員的要求較高。操作過程中若真空泵壓力過大，會導致卵丘細胞丟失，裸卵率較高；壓力過小則不易抽出卵母細胞，影響回收效率。因此，需要不斷調整真空泵的壓力，以獲取數量多且質量好的COCs。而目前的研究結果顯示，屠宰場卵巢獲得的COCs體外成熟效果要優于OPU來源的COCs[6]。這一結果可能與獲取卵母細胞時的卵泡大小和卵丘細胞特征有關，因為卵泡大小和卵丘細胞特征是影響卵母細胞質量的重要因素[4]。但現階段在不損傷卵母細胞的情況下，通過卵泡大小和卵丘細胞特征來評估COCs后續發育能力的標準尚未建立，仍需更多更深入的研究。

1.2 體外成熟條件

卵泡內的微環境和母體之間通過信號傳遞來支持卵母細胞生長并使其逐漸獲得發育能力，兩者之間的雙向通信極其復雜，需要多個信號通路的協同作用，這種高度的復雜性使得辨別卵母細胞后續的受精和發育能力異常困難[7]。但研究證實卵母細胞一旦從卵泡中脫除，其發育潛力就會受到限制，發育的最大潛力也就被固定了[1]。因此，研究人員通過在基礎培養液（TCM199）中添加激素、血清、生長因子、抗氧化劑等物質，結合培養箱特定的環境條件，盡量模擬體內成熟環境，以達到最佳的體外成熟效果。

1.2.1 激素

促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）是IVM體系中最常見的激素添加劑。補充FSH和LH可以誘導卵丘細胞擴散、細胞核和細胞質成熟[8]。除此，類固醇激素LH在哺乳動物卵母細胞成熟過程中對減數分裂的恢復有重要作用[9]。盡管有研究表明牛COCs的卵丘細胞能夠在培養體系中分泌雌二醇（E2）和孕酮（P4）[10]，但是牛COCs的IVM體系通常采用微滴培養，即在礦物油覆蓋的培養介質中進行成熟，由于油的高吸收能力，介質中E2和P4的濃度會降低，從而影響COCs的成熟效果[11]。因此，IVM液中也常添加E2以促進COCs體外成熟，但添加P4的研究較少。

1.2.2 氣體環境

O2對于卵母細胞順利成熟非常重要，但O2水平較高會不利于卵母細胞成熟如活性氧（ROS）的產生，會損傷卵母細胞[12]。生理條件下卵泡液中的O2濃度在3%～13%之間，而大多數牛的IVM方案中使用20%的O2濃度，這相當于空氣中的O2濃度。因此，卵母細胞體外培養的氣體環境與體內條件差別很大。但也有研究報道，牛IVM期間用5%O2濃度不利于卵母細胞的成熟[13]。因此，現階段關于牛卵母細胞IVM過程中氣體環境影響的研究，尚未就卵母細胞成熟的最佳O2濃度得出一致的結論，需進一步研究探索。

1.2.3 抗氧化劑

ROS是配子和胚胎代謝過程中產生的生理副產物，是一種強大的氧化劑，低濃度的ROS在體內發揮著重要的生理作用，如促進卵母細胞的發育和調節植入前胚胎發育的速率等，然而，ROS濃度過高可誘導細胞內成分的氧化損傷和細胞凋亡，進而對細胞功能產生有害影響[14]。

由于ROS存在會對卵母細胞成熟產生不利影響，許多研究通過向培養液中添加抗氧化物質來消除ROS的影響，如褪黑素[15-16]、番茄紅素[17]、半胱氨酸[18]、白藜蘆醇[19]等，能夠有效地降低牛卵母細胞中ROS含量，提高成熟效果。但也有報道稱這些物質在提高胚胎發育能力方面差異不顯著[19]，而具體何種抗氧化物質在提高胚胎生產效率方面有突出的效果還未見報道。

1.2.4 血清、生長因子、糖類物質等

研究表明，在體外成熟液中添加10%的胎牛血清（FBS），有助于卵母細胞成熟及防止透明帶硬化[20]。目前FBS已成為IVM體系中的常規添加物之一，但進口FBS管控嚴格、價格昂貴，且FBS中未經鑒定的激素可能會影響培養基批次的一致性，因此，研究人員轉向探索無血清的替代培養液，用牛血清純化得到的白蛋白（BSA）作為替代，現已有商業化的無血清成熟培養基（如日本FHK公司的IVMD101，英國IVF Bioscience公司的BOIVM）被開發出來。

向IVM培養液中添加表皮生長因子（EGF）、胰島素樣生長因子（IGF）等能促進牛卵母細胞成熟、卵丘細胞擴展[21]。

IVM期間充足的葡萄糖供應是卵母細胞代謝的基本要求。在培養基中添加葡萄糖可促進牛卵母細胞減數分裂的恢復，但IVM期間高濃度的葡萄糖又不利于隨后的胚胎發育，研究發現這是由于細胞內ROS升高引起的[22]。當IVM期間使用較低的O2濃度培養，同時使用補充葡萄糖的成熟培養基會提高最終的囊胚率[23]。因此，葡萄糖可能與O2代謝密切相關，適量的葡萄糖補充與合適的O2濃度協同作用才能有助于胚胎發育。

2 體外受精

2.1 精子來源

通常成熟后的卵母細胞要與處理好的精子在體外條件下共孵育若干小時，才能完成體外受精過程，形成的合子中有一半的核物質來源于精子。報道稱精子為胚胎發育貢獻了用于第一次卵裂的中心粒和一些mRNA[24]，精子功能失調引起的受精延遲可能是導致卵母細胞老化和胚胎發育缺陷的重要因素[3]。許多研究也表明不同的種公牛，其精子的體外受精能力存在顯著差異[25-26]，可見精子來源也是限制體外胚胎生產效率的重要因素，因此，在以后的生產實踐中就需要挑選優秀的種公牛精液進行體外胚胎的生產。

2.2 體外受精液

目前研究中常用的受精體系有兩種，BO液和TALP液，國外也已有商業化的試劑（如美國MOFA公司的IVF培養基，英國IVF Bioscience公司的BO-IVF培養基）正在推廣使用。牛凍精經37℃水浴解凍后，需先用洗滌液處理，目前通用的處理方法是兩次離心法，但不同的受精體系，精液處理時所用離心力有所不同，離心力過高會損傷精子，過低會影響精子的分離效果。BO液和TALP液需要1500r/min，每次5min[27]；而商業化試劑的受精體系需要328g或400g，離心時間也不盡相同。因為離心機的轉速與離心力之間的換算關系與所用離心機的半徑有關，所以無法就研究中使用的轉速與商品試劑中的離心力相比較，因此，以后的研究中也建議明確精子處理的離心力，以便于后續類似的研究優化改進。

在體內條件下，精子獲能是精子在受精前必須經歷的一個重要階段，只有經過獲能的精子才具有受精能力，因而，在體外也同樣需要此步驟[28]。牛精子體外獲能的方法主要是化學藥物誘導，向受精液中加入肝素或鈣離子載體，其中肝素對精子有害影響小，較為常用[29]。BO液處理精子時還加入了咖啡因，使得精子獲能更快，增強了其獲能效果[6,27]。

不同的受精體系，受精時間不同，BO液一般為6～8h，TALP液一般為18～24h[30]。但無論何種受精體系，最終受精時調整后的精子濃度基本都為100萬～200萬個/mL。

在體外受精環節研究中，成熟后的卵母細胞一般要去除部分卵丘細胞，再與精子在受精液中共孵育[31]，而商品化培養液則一般要求保留卵丘細胞，盡量不要擾動擴散的卵丘細胞團塊。因此，在去除部分卵丘細胞以及對后續胚胎發育影響等方面值得去深入研究，得出更準確的結論。

3 體外胚胎培養

3.1 胚胎培養液

目前常用的牛體外胚胎培養液主要有CR1aa和SOF液兩種，這類培養體系要求培養過程中需不斷補充添加血清的新鮮培養液，直至第7d發育至囊胚階段。而商品化的培養液（如美國MOFA公司的IVC培養基，英國IVF Bioscience公司的BO-IVC培養基）則7d內無需補充新鮮培養液，大大方便了后期培養。但也有研究表明自配液與商品液的體外胚胎生產效率無顯著差別，但自配液成本要遠低于商品液，因此更傾向于自配體系的推廣使用[32]。

3.2 共培養

在哺乳動物中，胚胎早期發育是影響成功妊娠的最關鍵步驟之一，這主要發生在母體輸卵管內，母體輸卵管為配子受精前的準備、運輸、存活、受精和早期胚胎發育提供了最佳環境，胚胎—母體之間的有效聯系對早期胚胎的成功發育和存活是必需的[33]。因此，為了更好的模擬體內環境，研究者嘗試在牛體外胚胎培養液中加入一些細胞，使之與早期胚胎共培養，目前已經在自源、異源卵丘細胞[34]、非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）和輸卵管上皮細胞[35]、馬骨髓間充質干細胞和馬羊膜上皮干細胞[36]等方面進行了研究，結果可不同程度地提高體外胚胎發育效率和質量。但在操作過程中需要嚴格控制加入共培養細胞的濃度，濃度過高，會過多消耗培養液中的營養成分，產生較多的有害代謝產物，對胚胎發育產生不利影響。

3.3 培養環境

有研究表明胚胎在培養過程中暴露的環境可能會影響它們的質量和活力[37]。同牛的IVM方案中一樣，牛體外胚胎培養體系也都使用20%的O2濃度，而高O2濃度培養會導致ROS的產生增加，損傷細胞的線粒體功能，導致胚胎死亡，因而，培養過程中使用的O2濃度是牛體外胚胎產量的重要決定因素[3]。為此，許多研究者在胚胎培養液中添加抗氧化劑，以阻止ROS對胚胎的損傷，結果可顯著提高胚胎的質量和產量[38]。但也有研究指出在胚胎培養過程中可以使用低氧培養系統，當O2濃度從20%降至5%時，可觀察到胚胎發育率明顯增加[37]。而最近的研究表明低氧培養系統適用于無共培養細胞存在的情況下，共培養條件下仍需用20%的高O2培養系統[35,39]。因此，體外胚胎培養需要根據使用共培養細胞與否選擇不同的培養條件。

4 展望

綜上所述，影響牛體外胚胎生產效率的因素有很多，不能過于看重某一方面的因素，需要從體外培養液的成分和培養環境的整體效應來分析。我國的牛體外胚胎生產技術，雖然實驗研究上已接近發達國家的水平，不同實驗室都建立有各自的牛體外胚胎生產體系，但在生產實踐上卻不及一些發達國家。因此，以后的研究在注重提高體外胚胎生產效率的同時，更應注重提高體外胚胎移植后的發育潛力。研究人員可以和胚胎移植實踐者之間建立合作關系，進行胚胎移植試驗，以獲得更有意義的結論；或可以利用分子生物學和組學知識來確定體內、外胚胎在生物學特征方面的差異，以預測體外胚胎移植后存活的可能性。相信在不久的將來，研究者會很快開發出更優化的牛體外胚胎生產體系，應用于生產實踐，加快我國牛良種擴繁的進程。