C 型鈉鈦對犬卵母細胞體外成熟效果的影響

劉曉靜，秦毓敏，鐘友剛，田樹軍*

（1.河北農業大學動物科技學院，河北保定 071000；2.北京希諾谷生物科技有限公司，北京 102200；3.中國農業大學動物醫學院，北京 100089）

關鍵字：C 型鈉鈦；犬卵母細胞；成熟率

犬卵巢上成熟卵泡排出的卵母細胞仍需要在輸卵管內成熟2～3 d 才排出第一極體，這是犬卵母細胞區別于牛、羊、豬等其他物種的特點[1]。在犬卵母細胞成熟培養研究中，前人嘗試在培養液中添加促性腺激素[2]、生長因子[3]、各種血清[4]等物質，采用與犬輸卵管上皮細胞共培養[5]、將卵母細胞注入體外培養的輸卵管內[6]等方法，但成熟率仍不超過20%。兩步成熟法是先將卵母細胞放入減數分裂抑制劑中處理一段時間，再進行常規體外成熟培養[7]。亞胺環己酮、次黃嘌呤、環磷酸腺苷（Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP）類似物等均可在兩步成熟法中作為減數分裂抑制劑，但屬于非特異性抑制劑會對卵母細胞質量造成負面影響，從而降低卵母細胞的后續發育能力[8-9]。

C 型鈉鈦（C-type Natriuretic Peptide，CNP）是天然存在于小鼠卵泡中的一種生理性多肽，能夠阻滯卵母細胞減數分裂的發生[10]。研究證實，CNP 能提高牛卵母細胞體外成熟率和囊胚發育率[11]，同時在貓上也得到證實[12]。犬卵母細胞中CNP 及其受體的分布與其他物種一致[13]，都是由壁層顆粒細胞分泌，通過與卵丘顆粒細胞上的受體結合來發揮作用。本研究采用兩步培養法對犬卵母細胞進行體外成熟培養，對犬卵母細胞體外成熟體系中添加CNP 的適宜濃度和適宜處理時間進行篩選，以揭示CNP 對犬卵母細胞體外成熟效果的影響，并優化犬卵母細胞體外成熟培養體系。

1 材料與方法

1.1 試劑 M 199 培養基、胎牛血清和雙抗為Gibco 產品；垂體促卵泡素和垂體促黃體素為寧波第二激素廠產品；其余試劑除特殊說明外均為Sigma 產品。

1.2 卵母細胞采集 在動物醫院收集健康絕育犬的卵巢，置于37℃含有雙抗的生理鹽水中，在2～4 h 內運送至實驗室，去掉多余組織，用生理鹽水清洗3 次，放入割卵液（M 199+10%FBS）中用縱橫切割法盡可能的釋放卵丘卵母細胞，挑選卵丘細胞大于3 層、直徑大于110 μm 且胞質暗黑均勻的卵丘卵母細胞復合體（Cumulus-Oocyte Complexes，COCs）進行體外成熟培養。

1.3 體外成熟培養方法及試驗設計

1.3.1 CNP 影響犬卵母細胞核成熟進程的有效性驗證將合格的COCs 隨機分為2 組，分別放入事先平衡至少2 h 的對照組和實驗組的成熟液微滴（100 μL）中，進行成熟培養，每個微滴培養15～20 枚COCs，培養條件為38.5℃、體積分數為5% CO2和飽和濕度。對照組和實驗組分別在6、12、18、24 h 取出適量的COCs，進行核相觀察。

對照組培養液成分為含10%FBS 的M 199、1 nmol/L半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸鈉、1% 雙抗。實驗組培養液成分為含10%FBS 的M 199、1 nmol/L 半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸鈉、1%雙抗、50 nmol/L CNP。

1.3.2 篩選適宜的CNP 處理濃度 將合格的COCs 隨機分組，分別置入事先平衡至少2 h 的CNP 實驗組（CNP濃度分別為50、100、500、1 000 nmol/L）的成熟液微滴（100 μL）中，進行6 h 的第1 步成熟培養；然后將其轉入常規成熟液中進行時長為72 h 的第2 步成熟培養，期間每24 h 進行全換液。對照組在對照組培養液中成熟培養6 h，再在常規成熟液中成熟培養72 h，每24 h 進行全換液。于成熟培養結束時，對COCs 進行核相觀察。

常規成熟液成分為含10 %FBS 的M 199、1 nmol/L 半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸鈉、0.8 IU 促卵泡素、2 IU促黃體素、1 %雙抗。對照組處理液成分為含10 %FBS的M 199、1 nmol/L 半 胱 氨 酸、0.2 nmol/L 丙 酮 酸鈉、1 % 雙抗。實驗組處理液成分為含10 %FBS 的M 199、1 nmol/L 半胱氨酸、0.2 nmol/L 丙酮酸鈉、1 %雙抗、CNP（50、100、500、1 000 nmol/L）。

1.3.3 CNP 處理的適宜時長研究 將合格的COCs 隨機分組，放入CNP 濃度為100 nmol/L（經1.3.2 篩選得出）且事先平衡至少2 h 的成熟液微滴（100 μL）中，分別進行6、12、18、24 h 的第1 步成熟培養；然而將其轉入常規成熟液中進行時長為72 h 的第2 步成熟培養，期間每24 h 進行全換液。于成熟培養結束時，對COCs進行核相觀察。

1.4 卵母細胞染色判定核相

1.4.1 脫卵丘 將成熟的卵丘卵母細胞轉入1% 透明質酸酶中處理1 min，期間用槍口光滑的移液槍不斷輕輕吹打，然后將卵母細胞轉移至成熟培養滴中，更換與卵母細胞直徑相差不大的胚胎吸針，反復吹吸刮去卵母細胞周圍的卵丘細胞，等卵丘完全去除后，用割卵液充分潤洗3 遍，防止卵丘細胞影響核相的判讀。

1.4.2 染色 用胚胎吸針將裸卵轉移到10 mg/mL 的Hochest 33342 中進行5 min 避光染色。

1.4.3 核相判定 將染色后的裸卵在DPBS 中清洗3 遍，放入預先做好的成熟培養液微滴中，在倒置顯微鏡下，激發熒光，觀察細胞核染色情況，拍照并對核相進行判定，記錄不同時期卵母細胞的數量。

1.5 統計分析 結果用平均值±標準差表示，用統計軟件SPSS 21.0 進行單因素ANOVA 檢驗。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 CNP 影響犬卵母細胞減數分裂進程有效性驗證 體外成熟培養6、12、18、24 h 的犬卵母細胞 825 枚，分別脫卵丘染色并在熒光顯微鏡下觀察核相。根據細胞核形態分為生發泡期（Germinal Vesicle，GV）、生發泡破裂期（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD）、第1 次減數分裂中期（Metaphase I，MI）、第2 次減數分裂中期（Metaphase II，MII）、退化期（Degeneration，DE）。各時期犬卵母細胞的核相特征如圖1 所示，GV 期卵母細胞的核膜清晰可見；GVBD 期卵母細胞的核膜消失染色質擴散；MI 期染色質凝集在赤道面上；MII 期第一極體位于染色質附近或第一極體排除至卵周隙；DE 期則未見核物質，退化。從表1 可以看出，CNP 處理12 h組的存活率顯著高于對照組，GVBD-MI 期卵母細胞的比率顯著低于對照組，表明用CNP 處理12 h 后能提高卵母細胞的存活率，并且能夠在一定程度上阻滯犬卵母細胞減數分裂；CNP 處理18 h 組處于GV 期的卵母細胞顯著高于對照組，表明用CNP 處理卵母細胞18 h 后仍有阻滯卵母細胞減數分裂的作用。

2.2 不同濃度 CNP 處理對犬卵母細胞成熟效果的影響由表2 可知，500 nmol/L 組和1 000 nmol/L 組的存活率、GV、GVBD、MI 和MII 時期卵母細胞比例均極顯著低于對照組，DE 的卵母細胞比例極顯著高于對照組，表明高濃度的CNP 預處理不利于犬的體外成熟（In Vitro Maturation,IVM），并且能增加卵母細胞的退化率。50 nmol/L 組和100 nmol/L 組的存活率、GV、GVBD時期卵母細胞所占比率差異不顯著，但50 nmol/L 組MII 期卵母細胞所占比例顯著低于對照組和100 nmol/L組。說明100 nmol/L CNP 預處理犬卵母細胞有可能會提高犬卵母細胞的成熟率。

2.3 CNP 處理不同時間犬卵母細胞對成熟率的影響如表3 所示，CNP 處理12 h 組的存活率、MII 以及DE時期卵母細胞所占比例均極顯著高于對照組，說明用CNP 處理犬卵母細胞進行成熟培養是有利的；24 h 組存活率、GV 以及MII 時期比率均極顯著低于對照組，說明用CNP 預處理長時間后不利于犬卵母細胞成熟培養；12 h 組存活率、MII 和DE 時期比率均極顯著高于6 h 組、18 h 組和24 h 組，說明用CNP 預處理犬卵母細胞12 h 最利于犬卵母細胞體外成熟培養，可提其高體外成熟培養效果。

3 討 論

在卵母細胞體外成熟過程中，細胞核和細胞質同時成熟才能保證卵母細胞在體外受精后胚胎的發育能力。CNP 通過壁層顆粒細胞細胞分泌和卵丘細胞上鈉鈦受體NPR2（Natriuretic Peptide Receptor 2，NPR2）結合，通過激活鳥苷酸環化酶將環三磷酸鳥苷（Cyclic Guanosine Triphosphate，cGTP）轉化為環磷酸鳥苷（Cyclic Guanosine Monophosphate，cGMP），cGMP 通過細胞間隙進入卵母細胞內抑制磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）的活性，能夠維持卵母細胞內高水平的cAMP，從而維持減數分裂阻滯。目前已有研究證實CNP 能夠阻滯貓卵母細胞發生減數分裂[12]，CNP 處理卵母細胞可獲得更高的成熟率并且卵母細胞體外受精率和囊胚率顯著升高[11]。本研究進一步證實了CNP 在犬卵母細胞的體外培養上也能有效延后減數分裂的發生，12 h 組的GVBD-MI 卵母細胞占比顯著高于對照組，存活率也顯著高于對照組，表明CNP 在一定時間內能夠阻滯犬卵母細胞發生減數分裂作用，并隨著CNP 處理的時間增加，阻滯卵母細胞減數分裂的作用變得越來越弱，這與CNP 受體的數量下降有關[13]。

表1 CNP 影響犬卵母細胞核相進程有效性驗證結果

表2 不同濃度 CNP 處理對犬卵母細胞成熟效果的影響

表3 CNP 處理不同時間犬卵母細胞對成熟率的影響

有研究證實，在犬卵巢上剛排出卵母細胞時輸卵管液中孕酮含量很低，當卵母細胞成熟時才達到很高的濃度[14]。前人的一些實驗直接添加促性腺激素培養，結果成熟率普遍很低，退化率也偏高[15]，推測與卵母細胞直接在含有一定濃度促性腺激素激素中進行成熟培養有關，這可能會加快卵母細胞的退化和死亡。本研究結果顯示用CNP 處理犬卵母細胞適當的時間能夠提高卵母細胞的存活率，是否與預處理階段的成熟液中未加入促性腺激素有關則有待進一步研究證實。本研究根據犬特殊的生理特性，采用含有CNP 且不含促性腺激素的成熟液預處理犬卵母細胞進行第一步成熟培養，既可以阻滯細胞核成熟，又可降低卵母細胞發生退化和死亡的概率，然后再轉入常規培養液進行第2 步成熟培養，使犬卵母細胞成熟率得到提高，與CNP 在豬、牛[11]、羊以及貓[12]上的研究結論類似。這很可能是因為CNP 延緩了縫隙連接蛋白解體加強了卵丘細胞和卵母細胞間通訊，推遲了卵母細胞減數分裂的重新啟動，促進了卵母細胞核質發育的同步性，進而提高卵母細胞的發育能力。本研究為進一步探討CNP 促進卵母細胞核質發育同步從而提高卵母細胞發育能力奠定了基礎。

4 結 論

本實驗條件下，犬卵母細胞在含有100 nmol/LCNP 的培養液中體外成熟12 h（第1 步成熟培養），然后轉入常規培養液中繼續培養72 h（第2 步成熟培養），可提高犬卵母細胞的體外成熟培養效果。