兒茶素對脂肪前體細胞增殖和分化的影響

寇艷波，劉慶亞，張 波，湯仁仙，王玉剛 (徐州醫科大學江蘇省免疫與代謝重點實驗室,江蘇徐州221004)

0 引言

肥胖已成為全球流行性疾病。肥胖及其伴隨的各種并發癥,如高血脂、脂肪肝、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病,甚至腫瘤等正嚴重威脅著人類生命健康［1－2］。肥胖發生的根本原因是能量攝入長期大于能量消耗,過多的能源物質儲存于白色脂肪細胞中,造成成熟白色脂肪細胞的增生和肥大,最終引發肥胖［3］。機體中除了含有白色脂肪細胞外還含有另外兩種脂肪細胞：棕色脂肪細胞和米黃色脂肪細胞［4］。米黃色脂肪細胞主要存在于白色脂肪組織中,可與白色脂肪細胞來源于相同的前體細胞［5－6］。棕色脂肪細胞主要存在于棕色脂肪組織中。米黃色和棕色脂肪細胞均可高表達解偶聯蛋白1(ucoupling protein 1,Ucp1),將化學能轉變成熱能,是機體代謝的重要調控者。增加米黃色或棕色脂肪細胞的量,將增加機體能量的消耗,對于肥胖的發生具有重要的抑制作用。由于人體中棕色脂肪細胞只存在于嬰幼兒時期,因此,促進米黃色脂肪細胞的含量將是防治肥胖的新手段［7］。

白色和米黃色脂肪細胞的形成均受轉錄因子Pparγ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)的調控。脂肪前體細胞經不同的環境因素刺激可在Pparγ其他關鍵調控因子的影響下表達不同的功能蛋白［8］。白色脂肪細胞高表達p-HSL(phosphorylated Hormone sensitive lipase)和Perilipin 1；米黃色脂肪細胞在關鍵轉錄因子Prdm16(PR domain containing 16)的參與調控下高表達Ucp1。兒茶素在我們日常食用的食物和水果中分布廣泛,其中綠茶中含量非常高。綠茶素有提神清心、去脂減肥的功效,但其去脂減肥的作用機制尚不完全清楚。聯合利華曾通過臨床實驗證明兒茶素對減肥的作用,以普通飲料為對照,在不改變參與者正常生活習慣的情況下,連續飲用高兒茶素含量綠茶90天后,參與者們體質量、腰圍和內臟脂肪均明顯減少,表明兒茶素極有可能是綠茶具有減肥作用的關鍵物質。研究［9］表明兒茶素能夠影響成熟脂肪細胞的形成,因此具有潛在的減肥作用。

為更全面地了解兒茶素影響脂肪細胞形成的機制,本實驗著重從兒茶素對脂肪前體細胞的增殖,對脂肪前體細胞向白色脂肪細胞的分化和對脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞分化的影響進行了研究,現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠脂肪前體細胞系3T3-L1購自武漢大學細胞保藏中心。細胞誘導分化試劑包括IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、地塞米松、吲哚美辛、羅格列酮、三碘代-L-甲狀腺原氨酸購自Sigma。小鼠胰島素購自Peprotech。油紅染料購自Sigma。白色脂肪細胞標志性蛋白Pparγ、p-Hsl、Perilipin 1和米黃色脂肪細胞標志性蛋白Ucp1(Uncoupling protein 1)、Prdm16抗體購自 Abcam,內參 β-Actin抗體購自Abclonal。兒茶素購自生工生物工程有限公司。CCK-8試劑盒購自Dojindo。

1.2 方法

1.2.1 脂肪前體細胞系誘導分化 用加有10%胎牛血清以及100 U/mL的青霉素和0.1 mg/mL的鏈霉素的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)高糖培養基,培養小鼠脂肪前體細胞3T3-L1至細胞匯合。更換新鮮培養基后繼續培養48 h使細胞接觸抑制。48 h后用無菌的PBS將細胞充分洗滌,換用新的含有白色脂肪細胞分化混合液(2 μg/mL地塞米松,0.5 mM IBMX,5 μg/mL胰島素)或米黃色脂肪細胞分化混合液(2 μg/mL地塞米松,0.5 mM IBMX,1 μM羅格列酮,1 nM三碘代-L-甲狀腺原氨酸,125 μM吲哚美辛,5 μg/mL胰島素)的培養基再次培養48 h,誘導分化。最后換用含有10 μg/mL胰島素(維持白色脂肪細胞分化)或5 μg/mL胰島素,1 μM羅格列酮,1 nM三碘代-L-甲狀腺原氨酸(維持米黃色脂肪細胞分化)的新鮮培養基繼續培養細胞并隔日換液,于第8天左右完成脂肪前體細胞的分化。

1.2.2 油紅染色 用異丙醇配制0.5%的油紅母液(現用現配),溶液經濾紙過濾后,按照油紅母液 ∶水(6∶4)的比例進行稀釋,獲得油紅染色工作液。分化成熟的脂肪細胞經PBS洗滌2遍后,加入4%多聚甲醛固定10 min。固定后的細胞經PBS漂洗后加入60%異丙醇浸洗2 min。棄掉異丙醇后,加入油紅工作液染色15 min。棄掉油紅染液后,細胞用60%的異丙醇再次洗滌至背景基本無色。顯微鏡觀察脂滴形成情況。

1.2.3 熒光定量PCR 收集分化前和分化后的3T3-L1細胞,提取RNA,取總RNA 1 μg進行逆轉錄獲得總cDNA,以不同組的cDNA為模板利用Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀檢測米黃色脂肪細胞標志性基因的轉錄情況,內參為 β-actin,引物序列如下：β-actin：5′CGTTGACATCCGTAAAGACC 3′和 5′AACAGTCCGCCTAGAAGCA 3′；Ucp1：5′AGAGGTCGTGAAGGTCAGAATG 3′和 5′TGACATTTCTCATTAGATTAGGGGT 3′；Pparγ：5′TTCAAGGGTGCCAGTTTCG 3′和 5′CCATCTTTATTCATCAGGGAGG 3′；Prdm16：5′GAGATGCTGACGGATACAGAGGT 3′和5′GGCGAGGTTTTGGTCATCAC 3′。

1.2.4 Western blot 細胞經含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解后,測定蛋白濃度。每孔上樣總蛋白30 μg進行SDS-PAGE,轉印至PVDF膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,用相應一抗4℃孵育過夜,洗滌后二抗孵育1 h再次洗滌后分別檢測目的蛋白存在。

1.2.5 細胞增殖實驗 小鼠脂肪前體細胞3T3-L1經血球板計數后,調整細胞濃度至2×103個/mL,分為四組(分別加入終濃度 0、25、50、100 μM 的兒茶素),接種到含有新鮮DMEM(高糖)完全培養基的96孔板中,每組12孔(3個孔為一個平行組),分別于0 h、24 h、36 h和48 h通過CCK-8試劑盒測定細胞的相對數量(按照操作手冊進行)。

1.3 統計學處理 采用Graph Pad Prism 5軟件進行統計分析,實驗數據采用x±s表示,兩組間比較采用t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兒茶素抑制脂肪前體細胞3T3-L1增殖 為檢測兒茶素是否能夠影響脂肪前體細胞的增殖,本研究通過CCK-8實驗檢測了兒茶素對脂肪前體細胞生長的影響。3T3-L1經胰酶消化后接種到含有不同濃度兒茶素的新鮮培養基中,每隔24 h觀察細胞形態并檢測細胞相對數量。如圖1A所示兒茶素能明顯抑制脂肪前體細胞的增殖,含有25 μM兒茶素的組別,3T3-L1最終生長量只達到對照組的55%左右；更高濃度的兒茶素幾乎完全抑制了細胞增殖。顯微鏡下觀察結果顯示,兒茶素并沒有影響細胞的正常形態(圖1B),雖然50 μM 和100 μM 的兒茶素幾乎完全抑制3T3-L1的增殖,但是并沒有出現細胞形態的異?；蚣毎麘腋〉默F象,暗示兒茶素可能并不會促進3T3-L1凋亡或壞死。

2.2 兒茶素抑制脂肪前體細胞3T3-L1向白色脂肪細胞分化 為確定兒茶素是否能夠抑制白色脂肪細胞的形成,我們研究了兒茶素對脂肪前體細胞向白色脂肪細胞分化的影響。由于高濃度的兒茶素具有強烈的細胞生長抑制作用,因此選用25 μM的兒茶素干預脂肪前體細胞向白色脂肪細胞的分化。3T3-L1完成接觸抑制后,添加白色脂肪分化混合液的同時,加入25 μM的兒茶素,并使后期維持分化的過程中,培養基中始終含有25 μM的兒茶素。細胞分化完成后,首先通過油紅染色觀察脂滴的形成情況,兒茶素的干預明顯抑制了白色脂肪細胞中脂滴的累積(圖2A)。與之相對應的是,Western blot結果表明,白色脂肪細胞標志蛋白Perlipin 1及磷酸化的Hsl的表達均受到明顯抑制,并且調控白色脂肪細胞形成的關鍵轉錄因子 Pparγ的表達也受到明顯抑制(圖2B),這與Lee等［10］的結果相一致。由此可知,兒茶素能夠抑制脂肪前體細胞向白色脂肪細胞分化。

圖2 兒茶素對白色脂肪細胞形成的影響

2.3 兒茶素不影響米黃色脂肪細胞的形成 為明確兒茶素是否能夠調控米黃色脂肪細胞的形成,我們檢測了兒茶素對脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞分化的影響。與白色脂肪細胞分化實驗相同,從刺激分化開始,始終保持培養基中含有25 μM兒茶素。油紅染色結果顯示兒茶素同樣可以抑制米黃色脂肪細胞中脂滴的累積(圖3A),雖然與白色脂肪細胞形成過程中結果類似,兒茶素輕微地抑制了Pparγ的表達,但不同的是兒茶素并不影響調控米黃色脂肪細胞形成的關鍵轉錄因子Prdm16以及米黃色脂肪細胞功能蛋白Ucp1的表達(圖3B、C)。綜合以上結果可知,雖然兒茶素能夠抑制米黃色脂肪細胞中脂滴的形成,但其并不影響米黃色脂肪細胞將化學能轉變為熱能的生物學功能。

A：油紅染色檢測胞內脂滴的形成；B：Western blot檢測米黃色脂肪細胞標志蛋白的表達；C：熒光定量PCR檢測米黃色脂肪細胞標志基因的轉錄

3 討論

隨著人們物質生活水平的不斷提高和生活方式的改變,肥胖人群比例日趨增加且愈發低齡化。其伴隨的各種并發癥正嚴重威脅著人類的身心健康［11］。肥胖發生的根本原因主要是能量攝入長期高于能量消耗,過多能源物質儲存造成白色脂肪細胞的增生和肥大,導致機體肥胖體征。因此,減少成熟白色脂肪細胞的數量或減小它們的體積,對于肥胖的防治均是有效的方法。此外,增加機體能量消耗減少能源物質的堆積也將是防止肥胖的有效手段。米黃色脂肪細胞高表達Ucp1,能將化學能轉變為熱能,可消耗體內儲存的能源物質,它們的增多能夠對肥胖的發生起到重要的抑制作用。由此可知,不管是減少脂肪細胞的數目還是抑制脂肪前體細胞向白色脂肪細胞分化或者促進脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞分化均是防治肥胖的有效方法。

兒茶素作為日常食物中廣泛存在的小分子物質,已被多次證明具有減肥的功效。已有研究［12］表明,兒茶素能夠抑制白色脂肪細胞的形成,因此能夠起到減肥的作用,本研究結果與之相符。添加25 μM的兒茶素后,脂肪前體細胞3T3-L1向白色脂肪細胞的分化受到明顯抑制,油紅染色顯示胞內脂滴積累量明顯減少。同時經CCK-8實驗檢測,兒茶素明顯抑制了脂肪前體細胞3T3-L1的增殖。由于脂肪細胞接觸抑制后,在刺激劑作用下重新進入有絲分裂,經克隆增殖后才進行分化［13］。兒茶素對脂肪前體細胞增殖的抑制作用可能是其抑制3T3-L1向白色脂肪細胞分化的關鍵原因。然而,在后續我們檢測兒茶素對脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞分化的過程中,發現同樣濃度的兒茶素,雖然抑制了米黃色脂肪細胞中脂滴的形成,但并不影響米黃色脂肪細胞分化關鍵轉錄因子Prdm16和關鍵功能蛋白Ucp1的表達,說明兒茶素可能并不影響脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞的分化。這也暗示了,兒茶素對脂肪前體細胞增殖的抑制作用并不是其抑制脂肪前體細胞向白色脂肪細胞分化的主要原因。此外,本研究觀察到在脂肪前體細胞向白色脂肪細胞分化過程中兒茶素明顯抑制了Pparγ的表達,而在向米黃色脂肪細胞分化過程中只有輕微的抑制作用,這可能與兩種分化過程受到的其它刺激因素不同有關。如米黃色脂肪形成過程中需要羅格列酮的存在,而恰有研究證明羅格列酮可以上調舌癌Tca8113細胞中Pparγ的表達。

兒茶素抑制脂肪前體細胞向白色脂肪細胞分化的研究較多。近年來,有研究［14］發現兒茶素能夠結合67LR(67 kDa laminin receptor),進而影響3T3-L1中脂多糖引起的TLR4(toll-like receptor 4)的活化,67LR可能是兒茶素抑制脂肪前體細胞向白色脂肪細胞分化的直接受體。也有研究［15］表明兒茶素可以通過結合脂筏,擾亂脂筏的正常功能而抑制脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞的分化。兒茶素的干預也影響了參與脂肪細胞分化的多條信號通路的改變,如PI3K-AKT、MEK/ERK、AMPK 等,這些信號途徑的改變進一步影響下游調控脂肪細胞分化的細胞因子的表達,最終決定脂肪前體細胞的分化命運［16］。兒茶素抑制米黃色脂肪細胞形成過程中脂滴的形成,但不影響米黃色脂肪細胞中Prdm16和Ucp1的表達,可能跟這兩個過程分別受不同信號通路調控有關。

本研究結果證明兒茶素能夠抑制脂肪前體細胞增殖,因此能夠一定程度上減少脂肪前體細胞的數量,進而減少引起肥胖的成熟白色脂肪細胞的數量；兒茶素還能夠抑制脂肪細胞中脂滴的形成,抑制脂肪前體細胞向白色脂肪細胞的分化,可進一步減少成熟白色脂肪細胞的數量；此外,兒茶素并不影響脂肪前體細胞向米黃色脂肪細胞的分化,不影響米黃色脂肪細胞對儲存的能源物質的消耗?？傮w來講,兒茶素可以在不抑制米黃色脂肪細胞能量消耗的情況下減少成熟白色脂肪細胞的數量,極有可能是兒茶素去脂減肥的關鍵原因。