新型CAR-T細胞靶向殺傷HPV16陽性宮頸癌細胞的探索研究

張 英，滕 嬌，汪 月，鄧麗娜，楊奕娜

(1深圳市寶安區中心醫院,廣東深圳518102；2深圳愛生再生醫學科技有限公司,廣東 深圳518118)

0 引言

在年輕女性中,宮頸癌發病率排名第二,嚴重威脅女性的健康［1］。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是宮頸癌的主要致病因子。有研究報道,約90%的宮頸癌是由 HPV持續性感染導致的［2］。根據其致癌性,HPV可分為低危型和高危型兩種,其中高危型病毒主要包括HPV16和HPV18等,約 60%的宮頸癌與 HPV16 感染相關［3－4］。

現在可以通過接種疫苗來預防HPV持續感染和宮頸癌的發生［5－7］。但是預防性HPV疫苗不能清除已經發生的HPV感染,或治療HPV陽性的宮頸癌。在國內治療宮頸癌臨床上經常采用干擾素等改善全身或局部免疫功能,而不是直接針對病毒本身,無法有效清除HPV病毒,其治療效果存在爭議。因此,我們迫切需要開發治療HPV感染和宮頸癌的有效手段。

近年來,隨著腫瘤免疫學等新興學科和技術的迅速發展,腫瘤免疫療法取得重大突破,成為繼傳統手術、化療和放療之后新的腫瘤治療手段。腫瘤免疫療法的重要代表之一,嵌合抗原受體修飾的T細胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T),在治療血液腫瘤中獲得突出的療效［8－11］。 2017年,美國 FDA批準了兩款靶向CD19抗原的CAR-T細胞產品Kymriah和Yescarta上市,為治愈難治復發性B細胞前體急性淋巴性白血病或大B細胞淋巴瘤帶來希望。與此同時,開發治療實體瘤的CAR-T細胞日益受到重視,也面臨多方面的挑戰,如難以找到合適的靶標抗原［12－15］。 HPV 的 E6和 E7 蛋白是高危型 HPV 的主要致癌蛋白,其通過影響細胞周期、細胞凋亡等方面使宿主細胞永生化而致瘤。E7蛋白只在HPV感染的細胞、大多數HPV陽性宮頸癌細胞和癌前病變組織中持續表達,而在正常組織中不表達,因此其可以成為宮頸癌CAR-T細胞治療的理想靶點。在宮頸癌細胞中,部分E7蛋白可被蛋白酶體切割成短肽片段,由人類白細胞抗原((human lymphocyte antigen,HLA)呈遞在細胞表面,其形成的抗原肽-MHC復合物,可以被T細胞識別和攻擊。根據已有的研究報道,本實驗設計和制備靶向 HPV16 E711-19：HLA-A*0201復合物的CAR-T細胞,并在體外成功驗證其殺傷HPV16陽性的Ca Ski細胞株的能力,為開發CAR-T細胞治療宮頸癌提供了初步的研究支持。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 293T、Ca Ski和HeLa細胞為本實驗室原有保存樣品。X-Vivo 15培養基(Lonza,04-418Q)、RPMI-1640(Gibco,11875093)、DMEM(Gibco,11995065)、胎牛血清(達科為,6021011)、青霉素-鏈霉素溶液(碧云天,C0222)、胰蛋白酶(Gibco,25200056)、淋巴細胞分離液(Stem Cell,18051)、無菌生理鹽水(四川科倫藥業,H51021158),細胞凍存液(達科為,DKW36-CFM0100)、Dynabeads?Human T-Expander CD3/CD28(Thermo,11141D)、白細胞介素-2(peprotech,200-02-10)、白細胞介素-7(peprotech,200-07-10)、白細胞介素-15(peprotech,200-15-10)、branched polyethylenimine(Sigma,408727-100ML)、polybrene(SantaCruz,sc-134220)、Genomic DNA Purification Kit(Lifetech,K0512)、Maxi prep 質粒提取試劑盒(Qiagen,12262)、EGFRt mAb(Lilly,Cetuximab)、anti-human IgG Fc antibody-PE(Biolegend,409303)、anti-human CD4-FITC(Biolegend,300505)、mouse IgG1,κ isotype ctrl-FITC(Biolegend,400109)、anti-human CD8 -Cy5.5(Biolegend,344709)、mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody-Cy5.5(Biolegend,400149)、Cell Counting Kit-8(東仁化學,CK04)、人 IFN-γ ELISA檢測試劑盒(聯科生物,70-EK1801)、人白細胞介素-2高靈敏ELISA試劑盒(聯科生物,70-EK102HS-48)。

1.2 方法

1.2.1 合成靶向HPV16 E7：HLA的CAR基因 在特異性識別HPV16 E711-19：HLA-A*0201復合物單抗的基礎上,設計第三代CAR。CAR的胞外部分為CD8α前導肽、scFv序列和CD8α鉸鏈區,采用CD28的跨膜區和胞內激活域,4-1BB胞內激活域,以及CD3ζ片段。CAR通過“自切割”的多肽序列T2A與截短的EGFR(EGFRt)連接,用于CAR的表達檢測。本實驗設計的CAR結構如圖1所示。

圖1 CAR的組成元件示意圖

1.2.2 構建HPV16 E7：HLA CAR慢病毒表達載體根據CAR的氨基酸序列,設計相應的基因序列,并對密碼子進行優化。合成CAR的基因序列,將其連接到經Xba I和Sal I酶切的慢病毒表達載體pCDHEF1α-MCS-T2A-Puro中。酶切鑒定目的基因片段,并進行Sanger測序驗證。采用Qiagen Maxi prep試劑盒提取無內毒素的 pCDH-EF1α-HPV16 E7：HLA CAR-EGFRt、psPAX2和pMD2.G質粒。

1.2.3 包裝HPV16 E7：HLA CAR慢病毒 將293T細胞傳代至10 cm培養皿,置于培養箱中。待細胞匯合度達到70%,更換新鮮的無血清DMEM培養基。 分別取 8 μg 的 HPV16 E7：HLA CAR、psPAX2和 pMD2.G 質粒,溶于 480 μL 1×HBS(pH 7.4)。 將100 μmol/L PEI儲存液用1×HBS 稀釋至10 μmol/L,取360 μL PEI溶液滴加至質粒溶液,邊加邊混勻,室溫靜置20 min。將DNA-PEI混合物滴加到細胞培養皿中,置培養箱8 h,更換為含血清的完全培養基。48 h后,收集含病毒顆粒的培養基上清,4℃,500×g離心10 min。將離心獲得的上清用0.45 μm的濾膜過濾,將濾液轉至無菌離心管中,配平后,4℃,50 000×g離心2 h。離心結束后,小心將離心管中的液體吸去,加入1 mL PBS重懸病毒沉淀,置于－80℃保存。

1.2.4 T細胞的分離和激活 將抗凝處理的人外周血樣品轉移至一個15 mL無菌離心管內,800×g離心20 min。吸去血清層,然后向下層的外周血細胞層加入等體積的生理鹽水,輕輕上下顛倒混勻。取一根15 mL離心管,加入5 mL淋巴細胞分離液。使用移液器小心將稀釋的血樣沿管壁緩慢加至淋巴細胞分離試劑的上層,避免分離試劑與血樣的混合,800×g離心20 min。將處于中間的白色單核細胞層吸至一個新的無菌離心管中,加入等體積的生理鹽水輕輕混勻,800×g離心5 min,去除上清。重復清洗一次PBMC,調整細胞密度至5×107/mL,轉移至2 mL細胞凍存管。用PBS將Dynabeads洗滌2遍,取適量的Dynabeads加入到 PBMC中,輕輕混勻,室溫孵育20 min。將2 mL細胞凍存管插入磁極,室溫靜置1 min,然后輕輕倒置,將管內的液體倒出。將細胞凍存管從磁極中取出,加入3 mL X-Vivo 15培養基(含200 IU/mL IL-2,10 ng/mL IL-7,5 ng/mL IL-15和5 ng/mL IL-21),重懸細胞和beads混合物,并調整細胞密度至0.5－1×106/mL。將細胞置于37℃,5%CO2培養箱中連續48 h后,將細胞密度調整至1×106/mL。

1.2.5 制備 HPV16 E7：HLA CAR-T細胞 按照MOI＝20,計算所需要的病毒量。計算公式：所需病毒量(mL)＝(MOI*細胞數量)/病毒滴度。從－80℃超低溫冰箱中,取出慢病毒,迅速在37℃水浴鍋中解凍。向培養的T細胞中加入polybrene至終濃度為6 μg/mL和上述計算所得的病毒量,用移液器輕輕混勻,室溫800×g離心1 h。將培養器皿置于37℃,5%CO2的培養箱中,24 h后,更換培養基。每天輕輕吹打beads/細胞團至完全分開,并進行細胞計數,調整細胞密度至0.5－1×106/mL。第8天通過FACS檢測細胞EGFRt的表達(指示CAR-T細胞的陽性率),并檢測CD4+T、CD8+T細胞的比例。離心收集制備的CAR-T,進行分裝和凍存。

1.2.6 CCK-8法檢測HPV16 E7：HLA CAR-T細胞的細胞毒性 采用細胞增殖-毒性檢測試劑盒檢測HPV16 E7：HLA CAR-T細胞對 Ca Ski和 HeLa細胞的殺傷效果。取96孔細胞培養板,每孔接種1×104個Ca Ski或 HeLa細胞(100 μL DMEM 培養基),在37℃,5%CO2條件下培養過夜。向各孔分別加入1×104、5×104、10×104和 20×104個 HPV16 E7：HLA CAR-T細胞(100 μL RPMI-1640培養基),對照組不接種CAR-T細胞,每組3個平行孔。共培養4 h。吸取培養基上清,PBS洗滌培養板孔中細胞兩次,去除殘留的CAR-T細胞后用于細胞因子檢測。在原孔加入 100 μL DMEM 培養基,加入 10 μL CCK-8 溶液,置37℃,5%CO2共孵育2 h。用酶標儀測定OD 450 nm。

細胞活力＝［(As-Ab)/(Ac-Ab)］×100%。 As實驗孔(含有癌細胞的培養孔、加入CAR-T細胞,加CCK-8)；Ac對照孔(含有癌細胞的培養孔、不加CAR-T細胞,加CCK-8)；Ab空白孔(不含癌細胞和CAR-T細胞的培養孔、加培養基、加CCK-8)。

1.2.7 ELISA檢測IFN-γ和IL-2水平 將上述實驗中 HPV16 E7：HLA CAR-T 細胞對與 Ca Ski、HeLa細胞(HPV16 E7：HLA CAR-T 細胞與 Ca Ski、HeLa細胞濃度比例分別都是10∶1)共孵育4 h后收集的培養基上清,12 000 rpm離心5 min,吸取上清。按照人IFN-γ ELISA或人白細胞介素-2高靈敏檢測試劑盒說明書,進行細胞因子檢測實驗。檢測結果用Graph-Pad Prism 7軟件計算x±s。

2 結果

2.1 CAR慢病毒表達載體構建 利用XbaI和SalI酶將克隆的HPV16 E7：HLA CAR表達質粒進行酶切和瓊脂糖凝膠電泳,可以觀察到被切割的目的片段在1500 bp和2000 bp之間,與預期的片段大小一致,表明CAR和EGFRt序列成功連接到表達質粒中。

圖2 HPV16 E7：HLA CAR表達質粒酶切產物電泳

2.2 HPV16 E7：HLA CAR-T細胞構建及鑒定

FACS分析EGFRt的表達：紅色和藍色部分分別為T細胞對照組、HPV16 E7：HLA CAR-T細胞實驗組利用EGFRt抗體進行免疫熒光染色后的流式細胞術分析結果。CAR-T細胞EGFRt表達率為41.2%,即T細胞的慢病毒轉導效率。

圖3 FACS檢測EGFRt的表達水平

CAR-T細胞亞群檢查：紅色部分為陰性對照組,藍色部分為HPV16 E7：HLA CAR-T細胞利用 CD4或CD8抗體進行免疫熒光染色后的流式細胞術分析結果：(A)CD4+的CAR-T細胞為85.2%,(B)CD8+的CAR-T細胞為30.9%。

圖4 FACS分析CD4+以及CD8+的細胞亞群比例

2.3 HPV16 E7：HLA CAR-T細胞體外對Ca Ski細胞殺傷作用橫坐標是HPV16 E7：HLA CAR-T細胞數,縱坐標是靶細胞活力。從圖中可以看出,HPV16 E7：HLA CAR-T細胞數量與對Ca Ski細胞的殺傷效果成正比。CAR-T細胞與Ca Ski細胞數比值是1∶1、5∶1、10∶1、20∶1時對應的 Ca Ski細胞活力為97.2%、83.2%、56.8%、24.8%,而對HeLa細胞的殺傷作用較小,CAR-T細胞與HeLa細胞數比值是1∶1、5∶1、10∶1、20∶1時對應的HeLa細胞活力為95.1%、103.7%、98.3%、50.7%。 HPV16 E7：HLA CAR-T細胞對Hela細胞的殺傷是在其10倍細胞濃度之前包括10倍情況下無殺傷,20倍細胞濃度的情況下才有較強的殺傷效果。

2.4 ELISA檢測IFN-γ、IL-2的分泌水平 HPV16 E7：HLA CAR-T 細胞與 Ca Ski、HeLa 細胞濃度比例分別都是10：1時經人IFN-γ ELISA檢測試劑盒檢測,殺傷Ca Ski細胞上清的IFN-γ的濃度是100.213±8.037 pg/mL,殺傷HeLa細胞上清的IFN-γ的濃度是16.111±3.181 pg/mL。經人白細胞介素2高敏ELISA試劑盒檢測殺傷Ca Ski細胞上清的IL-2的濃度是24.313±3.710 pg/mL,殺傷HeLa細胞上清的IL-2的濃度是6.472±3.489 pg/mL。IFN-γ和白細胞介素2具有免疫調節和抗腫瘤的作用,試驗結果測的細胞因子濃度和殺傷試驗效果結果相符合,即殺傷效果越明顯,相應的細胞因子就越多。

3 討論

在女性所患癌癥中,宮頸癌的發病率較高,目前主要治療手段有手術、放療、化療、靶向藥物治療等。此外,宮頸癌可以通過接種HPV疫苗來預防。隨著對宮頸癌認識的深入和醫療技術的提高,提高患者術后生活質量,但是手術治療不能應對已發生轉移的患者。放療容易對患者的卵巢功能造成損傷,大多用于晚期宮頸癌患者?；煻拘源?腫瘤容易產生耐藥性。因此,我們希望能夠開發出一種比較安全高效的治療手段。腫瘤免疫療法在2013年被《Science》雜志評為年度十大科技突破之首,顯示的強大的抗腫瘤效果。CAR-T細胞技術作為腫瘤免疫療法的重要代表之一,可以用于開發治療宮頸癌的新技術。

與靶向腫瘤細胞表面蛋白制備的CAR-T細胞相比,靶向抗原肽-MHC復合物的CAR-T細胞特異性高,脫靶毒性小。本實驗設計和構建了針對抗原肽-MHC復合物的HPV16 E7：HLA CAR-T細胞,并開展了相關體外細胞實驗,對體外殺傷實體瘤細胞進行了初步的探索。本實驗證明了制備HPV16 E7：HLA CAR-T細胞是可行的,且具有較高的細胞毒性。在體外殺傷試驗中,對非靶細胞在20倍細胞濃度的情況下也有殺傷,分析可能是因為隨著細胞數量的增大,CAR-T細胞表面的的其他T細胞抗原受體和癌細胞結合,非靶向抗原肽-MHC復合物的殺傷。本實驗主要進行了CAR-T細胞構建和初步的體外細胞實驗,結果顯示對靶細胞Ca Ski具有明顯的殺傷效果,為動物試驗和后續深入研究奠定了初步的研究基礎。