人臍血間充質干細胞通過TERT與腦缺血相關的研究進展

黃曉慧 張雙立 向文強 付國嬌 王曉鶴 馬學玲

人臍血間充質干細胞由于其獨特的生物學特性，已經成為腦缺血的潛在治療方法。TERT是基因編碼逆轉錄酶活性的蛋白質。它的主要功能是構建端粒酶活性，保持染色體的完整性及防止DNA損傷。近年來研究發現，TERT主要通過抗凋亡、血管生成、神經元存活和神經發生等方面在缺血性腦損傷后發揮神經保護作用。缺血性腦血管病是人類致殘甚至死亡的主要疾病之一，由于短暫或持續的腦血流減少而造成腦細胞損傷，因此恢復腦血流、促進血管再生對腦功能恢復至關重要。人臍血間充質干細胞及TERT對血管機能及神經發生方面的作用為進一步研究及了解其在血管生成及神經保護方面中的機制提供重要依據，也為缺血性腦血管病的治療提供新的發展方向。

腦卒中是全球疾病的第三大發病原因，更是全球疾病的第二大死亡原因，全球每年的腦卒中患者有1 500萬人，其中500萬腦卒中患者死亡，另有500萬左右的患者造成永久性殘疾，缺血性腦卒中的發病率占所有腦卒中的70%～80%，由于有效治療方案的限制，使得它是導致嚴重長期殘疾的主要原因，更是公共衛生的重大挑戰及負擔[1-4]。缺血性腦卒中是一種局灶性腦損傷，常常導致嚴重影響生活質量的許多不良神經系統并發癥。也是全球疾病中運動、感覺、認知功能障礙及死亡的主要原因之一[5]。

迄今為止，盡管對急性缺血性腦卒中機制的了解有所進展，但FDA所批準的治療仍然是靜脈注射重組組織纖溶酶原激活物，但許多缺血性腦卒中的患者不能從這種干預中受益[6-7]。不幸的是，除了需要短時間的溶栓治療窗外，還沒有證據證明可以有效地促進神經元功能恢復的治療，因為腦缺血后神經元損傷可能涉及的機制是多方面的[5,8]。干細胞是治療腦卒中的潛在策略。在最近的幾十年里干細胞的療法已經成為了恢復腦卒中功能的潛在途徑[9]。在腦卒中的臨床試驗中使用干細胞主要是針對腦卒中的亞急性和慢性階段的研究[10]。有相關臨床前和臨床的研道表明，干細胞在臨床中的治療有可能改善腦卒中患者的療效。移植干細胞的治療不僅為腦卒中提供了一個新的有希望的治療策略，更是實際修復受傷大腦，防止其持續損傷的常規的重點治療方法[6]。

1 人臍血間充質干細胞(hUCB-MSCs)的介紹

目前提出的神經保護策略有許多，但是對于這種疾病的進展這些策略卻絕對不能有效地抑制或逆轉[11]。在尋求更有效的治療方法時作為候選治療劑的干細胞是從各種組織中研發出來的。已經成為替代性干細胞的細胞來源的是骨髓和人臍血干細胞[6]。其中，人臍血間充質干細胞(hUCB-MSCs)具有的優點是優于其他類型干細胞(包括衍生自骨髓的干細胞)[12]。鑒于倫理考慮，人臍血間充質干細胞(hUCB-MSCs)是細胞治療的最佳選擇。

2 hUCB-MSCs的生物學特性

人臍血間充質干細胞(hUCB-MSCs)來源特點是一種無倫理爭議、獨特的、無痛的獲得并且可以表達豐富，表達低水平的人白細胞抗原-1，并且具有高免疫耐受性及干性性能[13]；它也具有自我更新、擴張潛力、降低移植物抗宿主病發病率以及造血祖細胞具有豐富的增殖擴增率,抑制外周血單核細胞增殖作用等特點。隨著與胚胎干細胞密切的遺傳關系，它的增殖速度快于成人的MSCs，并且 hUCB-MSCs具有免疫特異性[14]。2013年Liu R等[15]證實，腦脊髓炎小鼠的行為功能和組織病理學損傷是由hUCB-MSCs通過調節髓鞘再生和免疫炎癥來改善自身免疫性；其還可以通過TGF-β調節外周免疫來實現神經保護作用。Liu等[16]提出，除了調節同種異體免疫系統的能力外，由于可以低水平地表達多能胚胎干細胞標記因子(如POUF1，NANOG，SOX2和LIN28)，hUCB-MSCs形成畸胎瘤的可能性很小。Hsieh等[17]經實驗證實，hUCB-MSCs可以通過分泌因子在缺血性腦卒中的動物模型中促進神經保護，增強神經發生和血管生成。2012年Petrova等[18]發現，其旁分泌機制可以分化血管內皮細胞，增加VEGF的表達。Aronin等[19]經研究發現，其間接旁分泌機制可以分泌神經營養因子和抗凋亡因子，具有抗炎、誘導神經和血管發生的能力，更有加速神經恢復和神經行為改善的能力。hUCB-MSCs移植導致新生細胞、血管生成和組織修復因子的增多，減少半暗帶炎性事件的發生。

2012年Kim等提出，hUCB-MSCs衍生的MSCs在缺血性腦卒中模型中介導血運的重建。它的干細胞與神經營養因子的移植促使神經功能的恢復。2011年Lin等研究發現hUCB-MSCs由血管生成素(Ang)/ Tie介導的腦卒中治療會增加血管生成和血管穩定。2015年Zhao等[20]經實驗證實，其誘導Ang1和Tie2表達增加Ang1和Ang2有助于缺血性腦卒中的血管重塑，在腦卒中后的功能恢復中起重要作用。2012年Lees等[21]體內研究中發現，hUCB-MSCs的植入能夠改善受損大腦的內部環境，減少缺血性腦卒中大鼠的梗死體積，進而改善了神經行為功能。已有實驗證實hUCB-MSCs增強可塑性是通過分化為神經元和星形膠質細胞來顯著減輕MCAO模型的缺血性損傷來實現的。綜上所述，hUCB-MSCs對腦缺血性疾病具有有益作用，特別是通過血管生成、神經發生、神經元分化、神經修復和保護等方面，因此可用作治療神經系統疾病如腦缺血的治療劑。

3 TERT的介紹

端粒是位于真核染色體末端的保護結構，縮短每個細胞分裂間期。它具有保護染色體末端DNA-蛋白復合物的作用。端粒酶是一種逆轉錄酶，在DNA復制過程中維持端粒長度并防止細胞衰老是通過催化加入短端粒重復序列(TTAGGG)來完成的。端粒酶是由催化亞單位TERT和RNA模板組分(TERC或TR)組成的核糖核蛋白復合物，這兩者都是維持端粒長度所必需的[22]。TERT在大腦中廣泛表達于胚胎期和出生后早期。端粒酶逆轉錄酶(TERT)是基因編碼逆轉錄酶活性的蛋白質，也是端粒酶活性的關鍵調節因子和速率限制因素。TERT發揮重要作用是保持端粒長度方面，進而防止基因組不穩定性事件的發生。TERT參與了機體很多缺血性損傷的病理學過程及激活機制，其在缺血性腦損傷發揮保護作用。

4 TERT的生物學特性

構建端粒酶活性是TERT的原始功能，進而在細胞分裂過程中維持端粒長度。保持染色體的完整性是TERT的主要功能，可抑制端粒短路引起的細胞凋亡。因此，TERT的抗凋亡作用是通過維持染色體完整性和防止DNA損傷來實現的[23]。它的經典作用是通過防止端粒的縮短來穩定染色體DNA。對預防神經元凋亡至關重要的是其維持端粒完整性的逆轉錄酶活性。TERT可改善線粒體功能，有利于細胞存活而非應激誘導的細胞死亡。2001年Lu等提出在中樞神經系統中TERT保護神經元免受DNA損傷誘導的細胞凋亡。2013年Li J[23]研究發現，TERT活化抑制線粒體凋亡途徑可以在線粒體改變和半胱天冬酶活化之前完成。2006年Massard等發現這種作用是通過與Bcl-2家族的相互作用有關，通過激活Bax，Bcl-2家族的促凋亡因子，TERT抑制線粒體凋亡。2014年Kovalenko等[24]經實驗證實，TERT通過與mtDNA結合來保護線粒體DNA(mtDNA)免受損傷，與復合物-I相互作用減少細胞活性氧(ROS)產生，增加線粒體膜電位改善線粒體耦合，進而直接保護線粒體功能，從而減少凋亡。2012年Zhao等證實TERT通過抑制胱天蛋白酶-3的活化來作為抗凋亡蛋白，其機制需進一步研究。Lee等[25]提出，TERT可以抑制缺血后小鼠腦中培養神經元的線粒體的凋亡途徑。因此，TERT抑制線粒體凋亡作用也可以作用于缺血性腦損傷中。

血管生成在缺血缺氧損傷后腦修復中起重要作用。Li J等體內研究證實，TERT可以誘導缺血組織中血管生成和新生毛細血管，也是VEGF-依賴性血管生成和血流量增加所必需的[23]。2005年 Zaccagnini等提出其潛在的機制涉及促進內皮細胞血管生成、增殖和分化，保護內皮細胞免于細胞凋亡的特性，在缺血性損傷后的血管生成中發揮關鍵作用是其作為VEGF信號的下游效應。2007年Bermudez等研究發現，VEGF通過NO，ERK 1/2和PI3K/AKT途徑及部分轉錄水平誘導TERT表達。2009年Zhou等證實TERT是潛在的VEGF增強子，是由于hTERT以非依賴端粒酶方式在轉錄水平誘導VEGF表達?？傊?，2013年Ding等[26]提出，TERT和VEGF之間可能存在一個積極的調節反饋回路，調節彼此的轉錄表達并有助于血管生成。2014年Zhao等[27]發現TERT通過增強缺血后血管生成起到神經保護作用。

神經元存活和神經發生是缺血性損傷后腦修復的主要事件。2001年Klapper等提出，在大腦發育過程中TERT參與神經元分化和存活。隨后Mattson等研究發現，TERT可以促進神經元的存活，其被抑制可顯著減少體外神經元的存活。2004年Kang等發現，HI引起的神經元調亡可由TERT上調改善。2010年Duan經實驗證實，在HI損傷后用TERT轉染的星形膠質細胞的培養基中發現培養神經元的存活率顯著升高，并提出其在培養星形膠質細胞中是上調作用以應對缺血治療。2011年Qu[28]研究發現，TERT上調減弱星形膠質細胞增殖并促進HI后神經元存活，與星形膠質細胞中p15和NT-3表達增強有關，因為NT-3在腦缺血中發揮神經保護功能，NT-3表達的延長可能有助于TERT對HI損傷的神經保護作用。TERT介導神經元存活的潛在機制可能歸因于其增強不同信號通路的激活能力。2013年Pikula等[29]提出，神經營養因子家族的成員中BDNF具有促進神經元分化及存活、神經可塑性和神經發生的作用。Zhao 等[30]發現BDNF的自我保護反應表現在缺氧缺血后培養的神經元和腦中的表達增加。已有實驗證實PI3和p24/p44 MAP激酶途徑促進了TERT的上調和BDNF的存活。Pikula等[29]臨床研究表明血清BDNF濃度較低導致腦卒中/TIA的發生率增加，表明BDNF是腦卒中/TIA的風險標志。2007年 Schabitz等研究發現BDNF神經元在腦卒中可獲得有益效果。BDNF可以增加發育中神經元TERT的表達水平[23]。TERT和BDNF修飾的hUCB-MSCs可能具有長期增強和維持神經分化的作用，hUCB-MSCs將TERT和BDNF兩個神經保護因子帶入受傷區域，從而促進缺氧缺血性腦損傷后神經功能的恢復[27]。所以，TERT可以在HI腦損傷后發揮神經保護作用。

5 小結與展望

缺血性腦卒中主要以神經細胞、神經膠質細胞、少突膠質細胞發生壞死和突觸結構破壞為特征。腦缺血后發生一系列損傷級聯反應引起腦組織缺血性損傷，而體內神經保護機制也同時啟動，其作用機制涉及細胞因子、離子平衡、能量代謝、一氧化氮(NO)等多個環節，通過增強內源性神經保護作用，抑制缺血損傷反應，從而減輕腦細胞損傷[31]。2009 年 Deepti Navaratna 等人提出促進大腦缺血病灶的血管新生可能是提高腦卒中康復結果的唯一機會，并進行包括生長因子、粘附分子及祖細胞等的研究，認為這些因素可作為刺激大腦血管再生的潛在機制。

而近年來hUCB-MSCs在缺血性腦血管病的作用成為了研究熱點。2006年Newcomb經研究證實hUCB-MSCs在缺血性損傷治療48 h后仍然有效，表明hUCB-MSCs可延長治療時間窗。hUCB-MSCs移植顯著改善了缺血性腦損傷患者后遺癥的神經功能，其有益效果與其遷移到受損腦區域并分化為神經元的能力有關[32]。缺血性損傷后大腦修復的基礎是血管生成。Lin等證實hUCB-MSCs植入缺血性腦卒中大鼠受損的大腦半球后可誘導血管發生，促進腦卒中后功能恢復。因此，hUCB-MSCs可能對缺血性腦血管病具有有益作用，可用作缺血性腦血管病的治療劑，這為研究其在血管再生、改善神經等方面的作用，進而為應用于治療缺血性腦血管病提供了重要參考。

神經元中TERT的上調改善了HI誘導的神經元死亡。TERT在HI腦損傷中的神經保護機制可能與減少興奮性毒性、促進血管生成、促進神經元存活和神經發生以及抗細胞凋亡作用有關。2010年Lee 等[33]提出TERT在維持腦功能和行為方面也起著重要作用；其潛在神經保護機制不是完全獨立的，而是相互重疊的[23]。2015年Bressler 等[34]證實TERT作為心血管疾病風險的決定因素還應用于社區動脈粥樣硬化風險(ARIC)研究中?？偠灾?，對hUCB-MSCs及TERT的研究和了解證實其在血管機能及神經保護方面具有重要調節作用，目前研究尚處于起步階段，但這些研究已提供了新的視角，有望在臨床相關診斷、治療及預后評估方面得到發展，可以展望將來基因治療會成為缺血性腦血管病治療的一種新興手段。