骨橋蛋白及炎癥反應與頸動脈粥樣硬化斑塊關系的研究進展

趙士嬌 韓雪 高燕軍

頸動脈粥樣硬化斑塊是一種纖維炎性脂質斑塊，是導致缺血性腦卒中的主要危險因素之一[1]，據相關文獻報道,在我國有45%～86.7%的腦梗死和頸動脈粥樣硬化斑塊有關,在歐美則有35%～76%[2]。斑塊破裂脫落阻塞遠端的顱內動脈進而引起缺血性腦血管事件的發生。Dirksen等[3]從尸檢資料中發現，巨噬細胞在頸動脈斑塊內的分布存在明顯差異，而斑塊內巨噬細胞數量是決定斑塊穩定性的重要因素，斑塊的穩定性隨巨噬細胞數量的增多而降低。在斑塊內部炎癥反應可通過誘發新血管生成及斑塊內出血而增加斑塊易損性。因此，包括骨橋蛋白(osteopontin,OPN)在內的炎癥因子在頸動脈粥樣硬化斑塊中的研究越來越受到各界重視，現將骨橋蛋白及炎癥反應在頸動脈粥樣硬化斑塊形成至轉變為易損斑塊中的作用作一綜述。

1 頸動脈粥樣硬化(carotid atherosclerosis，CAS)與易損斑塊

Chaturvedi等[4]調查發現，70歲以上的人群中有6.9%的女性和12.5%的男性有無癥狀的中度頸動脈粥樣硬化(狹窄率50%～70%)，在70歲以下的人群中有2.2%的女性和4.8%的男性有無癥狀的中度頸動脈粥樣硬化(狹窄率50%～70%)。上述事實證明無法單純用頸動脈狹窄程度來解釋缺血性腦卒中的發生。近年來，越來越多的學者認為腦卒中發生機制與斑塊的組織學特性即是否為易損斑塊密切相關[3]。在2003年Naghavi等[5]提出了關于易損斑塊的組織學特征：(1)薄纖維帽及大的脂質核心；(2)發生活動性炎性反應；(3)斑塊表面纖維帽破裂及隨后血栓形成；(4)內皮脫失后導致血小板聚集或纖維蛋白沉積；(5)斑塊內新生血管及斑塊內出血；在腦梗死致病機制中頸動脈斑塊的穩定性的作用逐漸被認識，斑塊破裂后可直接栓塞下游血管，裸露的含高凝物質的核心能迅速形成血栓，引起缺血性腦血管事件的發生[6]。

2 炎癥反應在頸動脈粥樣硬化發生各個階段的作用

有多種學說從不同的角度來闡述動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發病機制，如脂質浸潤學說、內皮損傷學說、血栓形成學說、受體學說、慢性炎癥學說、平滑肌細胞增殖學說等。隨著對動脈粥樣硬化機制研究的深入，AS的慢性炎癥性特征已被廣泛認可，1999年Ross[7]提出“AS是一種炎癥性疾病”。炎性進程貫穿于動脈粥樣硬化形成發生、發展的各個階段，即從早期血管內皮功能紊亂到最終斑塊破裂，動脈粥樣硬化具有經典炎癥變性、滲出及增生的特點，動脈粥樣硬化發病初期主要表現為急性滲出性炎癥,即單核巨噬細胞浸潤等，而在進展期主要表現出血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)大量增殖及細胞外基質過度合成等慢性增生性炎癥的特點[8]。

Wu等[9]證明T淋巴細胞和B淋巴細胞在伴有頸動脈粥樣硬化斑塊的患者體內活性顯著增強，同時其他的一些炎癥標志物表達也增多。頸動脈斑塊易損性與血清中的炎癥標志物高度相關，主要的相關炎癥標志物有CRP、hs-CRP、白細胞計數、IL-6、IL-8、SAA、纖維蛋白原、TNF-α、S100A蛋白、MMP家族、新喋呤及FABP4等。血管周邊的肥大細胞通過IL-8受體CXC趨化因子受體蛋白2(CXCR2)使斑塊內小血管的通透性增加，促進斑塊內出血及白細胞浸潤，多效性的細胞因子與CXCR2作用使巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)表達上調，并誘導基質金屬蛋白酶-9的表達[10]。相關研究表明，心腦血管不良事件的風險與頸動脈硬化斑塊中MIF的表達增加高度相關；一方面，斑塊中的炎性反應刺激斑塊內微小血管的生成，另一方面，炎癥反應可導致斑塊組織局部缺氧，更加促進斑塊中新生血管的形成。斑塊中的微血管由于結構及功能不成熟，極易增加斑塊內出血和斑塊破裂的風險[11]。由此可見，頸動脈粥樣硬化斑塊的自然傾向從一個穩定的斑塊轉變為易損斑塊主要取決于炎癥的程度。

3 骨橋蛋白(osteopontin，OPN)

3.1 OPN的結構、生物學功能及活性調節

骨橋蛋白(OPN)是一種特異性骨涎蛋白，首次是從大鼠肉瘤細胞克隆而成并因此得名而被知曉[12]。它是編碼在人類基因組中的4號染色體。它有幾個名字包括早期T淋巴細胞激活(ETA1)蛋白1，分泌磷酸化蛋白1(SPPl)和骨涎蛋白1(BSP1)。多個名稱表示OPN的多功能性，并且可以被多種類型的細胞表達。骨橋蛋白一種帶負電的磷酸化糖蛋白，廣泛存在人體多種組織如肺、肝、骨、腦等，作為一種多功能蛋白在多種細胞中表達，尤其是病理情況下(腫瘤、炎癥、免疫反應等)表達明顯增強[13]。骨橋蛋白的功能多樣性歸因于兩個主要特點：第一，有3個已知的剪接變異體(亞型OPN-a、b、c)，具有不同的結構域和功能；另一個原因是翻譯后修飾包括磷酸化、糖基化、硫酸化，酶裂解與蛋白質交聯。選擇性剪接和翻譯后修飾的聯合結果是產生多種不同的OPN形式，具有不同的生物活性以及與七種整合素和CD44受體結合的能力[14]。

OPN mRNA剪接主要是在人體組織中，主要在腫瘤細胞。這種剪接形成了3個剪接變體：OPN-a、opn-b和OPN-c[15]。OPN-a和OPN-b促進肺癌血管生成，增加血管內皮生長因子(VEGF)的表達，而OPN-c實際上可能抑制血管生成[16]。最近的研究表明，OPN剪接變異體的作用不僅在惡性腫瘤，而且在退行性疾病如主動脈瓣鈣化中也起作用，其中OPN-a在疾病的早期階段時達到高峰，OPN-b和OPN-c水平隨主動脈鈣化的進展而增加[17]。

除了明顯調節的mRNA剪接外，OPN還可以通過大量的翻譯后修飾如絲氨酸/蘇氨酸磷酸化、糖基化和酪氨酸硫酸化，導致單體分子量范圍在41～75 kDa之間[18]，從而產生不同的作用。重組非磷酸化OPN增加血管平滑肌細胞的礦化，而酶促磷酸化OPN是一種強效的血管鈣化抑制劑。Christensen等研究證明了高度磷酸化的OPN與較少磷酸化形式相比，在C-末端區域通過α(V)β(3)-整合素對細胞粘附有較高的抑制作用；另一個重要的影響OPN活性的翻譯后修飾是酶裂解。OPN形成幾種蛋白酶切割位點與細胞相互作用的結構域，切割位點包括凝血酶和幾種基質金屬蛋白酶(MMPs)裂解位點[19]。細胞相互作用域包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)細胞結合序列和絲氨酸-纈氨酸-纈氨酸-酪氨酸-谷氨酸-亮氨酸精氨酸(SVVYGLR)功能域。SVVYGLR功能域是隱藏的，只在凝血酶介導的裂解過程中顯示出來。RGD和SVVYGLR域通過與細胞表面的整合素相互作用激活細胞信號轉導。OPN通過RGD、SVVYGLR序列能夠與細胞表面的多種整合素受體如整合素αvβ1、αvβ3、αvβ5、α4β1(多在炎性細胞中表達如淋巴細胞、單核-巨噬細胞)等相互作用而調節細胞黏附、遷移、增殖等多種生物學行為。OPN通過這2個黏附序列來介導細胞-細胞、細胞-基質間的黏附和細胞信號傳導，并促進血管平滑肌細胞由中膜向內膜的遷移及以巨噬細胞為主的炎性細胞向損傷部位的聚集，加速動脈粥樣硬化進程。體外研究表明，含RGD序列的多肽可以阻止OPN與αvβ3相互作用，從而可以抑制血管平滑肌細胞遷移、減緩血管內皮損傷后的再狹窄[20]。

3.2 OPN與炎癥

如上所述，多種整合素通過OPN的RGD、SLAYGLR結構域與OPN相互作用，這兩種結構域通過調節遷移、存活和組織積聚而在巨噬細胞生物學領域發揮關鍵作用。OPN也與各種促炎細胞因子相互作用，包括TNF-α和IL-1β，它們可以增加OPN的表達[21]，并且OPN還可以與動脈粥樣硬化過程更為相關的其他的炎癥介質相互作用如血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和氧化低密度脂蛋白。AngⅡ是動脈粥樣硬化過程的中介，在動脈壁主要誘導OPN的表達[22]。氧化低密度脂蛋白增加OPN在各種血管細胞包括血管平滑肌細胞、內皮細胞和成纖維細胞中的表達。OPN是巨噬細胞和T細胞的強趨化因子[23]，能夠增強巨噬細胞和輔助性T細胞的活動，如增加T細胞表達CD3和活性氧的生成。OPN誘導的氧化應激可能是加速動脈粥樣硬化形成、促進活性不穩定斑塊的形成的機制之一。

OPN既可作為促炎細胞因子又可作為抗炎細胞因子，是炎癥環境中的關鍵因子[24]。OPN的高促炎活性在凝血酶裂解后更為明顯，酶裂解產生超高效N末端片段的產生，該片段帶有2個整合素激活結構域：RGD和SVVYGLR序列。OPN-N末端片段可能是OPN蛋白家族中的主要促炎癥介質。然而，OPN片段或剪接變異體中哪些片段主要發揮抗炎特性尚未明確。一些研究者認為OPN的C-末端片段可以減輕炎癥：Takahashi等[25]人通過細胞粘附試驗表明，OPN的C-末端片段的加入抑制了由OPN和OPN-N末端片段誘導的細胞粘附。Christensen等[26]證實了OPN的C-末端片段對細胞粘附的抑制作用取決于它的磷酸化。OPN-C末端的抗炎作用還可以歸因于它能夠抑制巨噬細胞向炎性病灶的遷移。因此，OPN不是單一的細胞因子；相反它是1個多肽，包括剪接變異體和多種活性蛋白裂解產物，具有免疫調節等功能。

3.3 OPN與頸動脈粥樣硬化斑塊

血管內皮細胞受損為動脈粥樣硬化形成的始動因素，當血管內膜受損時在細胞因子和生長因子的刺激下位于血管中膜的血管平滑肌細胞(VSMC)可由收縮表型轉化為合成表型，從而向內膜下遷移、增殖及合成和分泌大量細胞外基質(extracellular matrix，ECM)。血管平滑肌細胞的遷移主要是由細胞外基質蛋白和細胞表面整合素受體的相互作用所介導的。研究表明，OPN是各種細胞外基質蛋白中與細胞遷移和黏附的關系最為密切的。如前所述，0PN通過RGD、SVVYGLR這2個黏附序列促進VSMC由中膜向內膜的遷移及炎性細胞向損傷部位的聚集，從而介導血管平滑肌細胞的趨化、黏附和遷移[27]，而黏附、增殖與遷移是動脈粥樣硬化等血管重塑性疾病的細胞病理學基礎[28]。另外，動脈粥樣硬化斑塊中微血管形成(血管生成)有助于易損斑塊的形成，OPN可通過αvβ3/PI3-K/Akt/eNOS/NO信號通路，直接刺激血管生成[29]，進而增加斑塊破裂的風險。研究表明，OPN通過細胞介導炎癥反應致頸動脈粥樣硬化斑塊破損、纖維帽薄化，進而引起腦血管臨床事件發生[30]。OPN通過不同途徑參與頸動脈粥樣硬化的發生、發展，有實驗研究結果表明頸動脈粥樣硬化、頸動脈血管再狹窄部位的內皮細胞骨橋蛋白mRNA呈高表達狀態。動物實驗模型研究結果示內皮細胞、平滑肌細胞內骨橋蛋白mRNA的表達在頸動脈血管內皮損傷后明顯上調，8 h可達到高峰，持續14 d后逐漸下降，說明血清OPN參與形成了動脈粥樣硬化，導致斑塊不穩定性增高，可能導致較高的腦梗死發生率。Carbone等[31]對急性缺血性腦卒中患者研究發現，與事件剛發生時相比，7 d后血清OPN水平達到高峰，這時血清的OPN水平與腦缺血面積及第7 d、第10 d的NIHSS評分成正比。

OPN參與動脈粥樣硬化過程的所有步驟：它是斑塊形成以及斑塊特性的代表，在動脈粥樣硬化的發病機制中起著重要作用，它在炎癥和鈣化中有重要的調控作用。最后這2個因素對動脈粥樣硬化病變的性質有重要的影響，即是否形成穩定的、無并發癥的斑塊或者形成與增加癥狀性疾病的脆弱斑塊有關。近年來普遍認為，鈣化可以增強斑塊的穩定性，降低心腦血管事件的發生率，而OPN是一種強效的軟組織礦化抑制劑，從而可防止血管鈣化。OPN不僅在原發性頸動脈粥樣硬化過程中起作用，而且在血管重建術后頸動脈再狹窄中起作用。骨橋蛋白在血管損傷后重塑中的作用在另一項研究中證實，在頸動脈內膜剝脫前用抗OPN抗體治療可降低內膜增生[30]。

大多數現有的研究都認為OPN是1個單一的肽，其結論主要是歸因于全長蛋白。然而，目前的證據表明這種觀點可能是不完整的，忽略了OPN蛋白家族全部的生物學效應。凝血酶裂解OPN導致OPN-N端片段的形成，該片段比全長蛋白或OPN-C端片段具有更高的促炎癥的潛力。事實上，OPN-N末端片段而不是全長OPN和OPN-C末端片段與頸動脈斑塊的炎癥有關，因此并非OPN家族中的所有成員均具有促炎作用。血漿凝血酶切割的OPN與癥狀性腦血管病有更高的相關性[32]。

4 小結和展望

OPN不僅是頸動脈粥樣硬化的標志，而且可能是調節其斑塊穩定性的介質。當評價OPN作為治療靶點時特別是在針對促炎作用同時保留其抗炎作用，因此目標不應該瞄準完整的OPN，而應該針對OPN系統中的1個或多個成員：其不同剪接變異體和/或其裂解片段。具體、準確地操縱OPN系統將有助于斑塊穩定性，積極調整動脈粥樣硬化的自然病程，最終將改善患者結局。