IL-35抑制Th17細胞治療柯薩奇病毒B3誘導的病毒性心肌炎

張月婷，關玲霞，董平栓

病毒性心肌炎是指病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎癥病變，是猝死的常見病因之一，柯薩奇病毒被認為是其最重要的病原體[1]。雖然目前對病毒性心肌炎發病的具體分子機制還尚不清楚，但多項國內外研究證實[2-4]，機體因外源病原體入侵而過度激活的免疫反應在病毒性心肌炎發病過程中發揮著重要的作用。

白介素35（IL-35）是由一種新發現的Treg細胞合成分泌的，屬于IL-12家族，并具有免疫抑制功能的細胞因子。IL-35能夠促進CD4+CD25+細胞增長，抑制CD4+CD25-細胞增殖，同時也能夠抑制由CD4+CD25-細胞分化的Th17細胞的增殖，進而減輕關節炎和炎癥性腸病模型病情[5,6]。同時，Liu等[7]研究證實，IL-35可顯著抑制Th1和Th17細胞增殖，進而減緩結腸炎疾病進展。由此可以看出，IL-35具有的免疫抑制功能在炎性疾病和自身免疫性疾病中具有潛在應用價值。

本文通過柯薩奇病毒B3（CVB3）感染小鼠建立CVB3誘導的病毒性心肌炎模型，腹腔注射聚醚酰亞胺（PEI）包裝的IL-35表達質粒，以研究IL-35在病毒性心肌炎心臟組織的表達情況，并探討其對病毒性心肌炎的治療意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與病毒 選取6～8周齡BALB/c雄性小鼠共計60只（購買于中科院上海實驗中心，中國），適應性喂養1周后用于實驗；柯薩奇病毒通過HeLa細胞維持（購買于ATCC，美國），TCID50法測定病毒滴度。

1.2 實驗動物處理 實驗小鼠適應性喂養1周后，隨機分為4組（每組各15只），于實驗第1 d（d0）向感染組（IF組）、IL-35治療組（IL-35組）和空質粒治療組（p-FC組）腹腔注射103 TCID50 CVB3病毒。IL-35治療組：于CVB3感染前1 d（d-1）、感染第1 d（d1）和第3 d（d3）IL-35組小鼠腹腔注射由0.258 ng PEI（Sigma，美國）包裝的50 ug p-IL-35-FC質粒（由本實驗室自行構建，重懸于0.2 ml PBS中）?？召|粒治療組：p-FC組腹腔注射空載FC質粒。正常組（Normal組）小鼠在d-1、d0、d1和d3均腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 酶聯免疫吸附法檢測IL-35 各組分別于實驗第1、3、5和7 d各處死2只小鼠，分離心臟組織將新鮮分離的小鼠心臟組織樣本放到盛有液氮的研缽中，研磨成細粉，然后加入0.5 ml RIPA裂解液（碧云天生物，中國）（加1%PSMF）進行勻漿，然后，在4℃下10 000 rpm離心10 min后（eppendorf，德國）收集上清。通過小鼠IL-35 Elisa檢測試劑盒（南京森貝伽生物，中國）檢測心臟組織IL-35表達水平。

1.4 實驗動物心肌炎評分 各組分別于實驗第1、3、5和7 d各處死2只小鼠，用生理鹽水將小鼠心臟清洗干凈后，用10%福爾馬林溶液固定24 h以上，經脫水、透明、浸蠟、包埋和切片后進行HE染色，顯微鏡下觀察小鼠心臟組織，根據心臟組織病變程度進行心肌炎評分：以無炎癥病灶為0分；1-5個單核炎癥病灶，且病變面積＜5%為1分；單核心性炎癥病灶＞5個，或病變面積介于5%～20%為2分；彌漫性單核炎癥病變面積＞20%且無壞死性病變為3分；出現壞死彌漫性炎癥為4分。

1.5 流式細胞技術檢測Th17細胞 實驗第7 d結束處死各組小鼠，開腹取出脾臟，用200目過濾網擠壓過濾，然后用加10%胎牛血清（Hyclone，美國）1640培養基（Hyclone，美國），向脾細胞重懸液中加入ACK裂解緩沖液液（Gbico，美國）37℃孵育3 min，然后1000 rpm離心10 min收集細胞，再加入1640培養基（+10%胎牛血清）重懸細胞，制成1.0×106個/ml脾細胞重懸液；然后向脾細胞重懸液中加入50 ng/ml佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（Sigma，美國），1 ug/ml離子霉素（Sigma，美國）以及10 ug/ml布雷非德菌素A（Sigma，美國），37℃+5%CO2孵育4 h。

用PE-anti-mouse-CD14單克隆抗體（Abcam，英國）標記小鼠脾細胞表面標志物，抗小鼠IL-17A單克隆抗體（Abcam，英國）作為二抗，通過MACSQuant? Analyzer 10流式細胞儀（Miltenyi Biotec，德國）檢測Th17細胞數目。

1.6 統計學分析方法 研究數據通過SPSS 20.0軟件包進行統計學分析，計量資料以均數±標準差，組間比較采用t檢驗，Pearson法分析兩指標間的相關性，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CVB3感染后各組小鼠體重和心肌炎評分 正常小鼠在飼養1、3、5和7 d體重逐漸上升，感染CVB3病毒1、3、5和7 d后，BALB/c小鼠體重下降分別為（22.3±4.2）g、（18.3±2.6）g、（17.1±2.4）g和（13.2±1.8）g，心肌炎評分逐步升高分別為0.5、1.5、3.0和4.0分，p-FC組小鼠在感染1 d后體重有所上升，但隨后體重一直下降；IL-35組小鼠在感染CVB3病毒后體重均呈上升趨勢；感染CVB3病毒1、3、5和7 d后，在同一時間點IF組小鼠體重與p-FC體重對比，差異無統計學意義（P＞0.05），但均低于IL-35組小鼠（P＜0.05），見表1。而在感染CVB3病毒后，BALB/c小鼠心肌炎評分均呈上升趨勢，見圖1。

2.2 心臟IL-35表達與病毒性心肌炎小鼠疾病嚴重程度呈負相關 酶聯免疫吸附法檢測各組小鼠心臟組織IL-35表達量，并通過Pearson法分析IL-35表達與體重減輕重量、心肌炎評分的相關性，結果顯示：心臟IL-35表達水平與小鼠體重減輕重量（r=-0.532，P=0.034）和心肌炎評分（r=-0.670，P=0.005），呈負相關，見圖2～3。

表1 CVB3感染后各組小鼠體重變化（g）

圖1 CVB3感染后各組小鼠心肌炎評分變化

2.3 CVB3感染后各組小鼠脾臟Th17細胞比例CVB3感染小鼠7 d結束后，處死各組小鼠，通過流式細胞儀檢測各組小鼠脾臟Th17細胞比例，結果顯示：正常小鼠、IF組小鼠、IL-35組小鼠和p-FC組小鼠Th17細胞比例分別為（0.40±0.10）%、（1.30±0.20）%、（0.53±0.15）%和（1.33±0.21）%，見圖4。

圖2 心臟IL-35表達與CVB3感染小鼠后體重變化的關系

圖3 心臟IL-35表達與CVB3感染小鼠心肌炎評分的關系

圖4 IL-35過表達降低CVB3誘導心肌炎模型Th17細胞數量

3 討論

病毒性心肌炎是一種腸道病毒或腺病毒感染引起的心臟組織炎癥，病毒感染和過激的宿主免疫反應是引起病患死亡的兩個最主要原因。在CVB3感染早期，其可能通過破壞心肌營養不良蛋白-肌內聚糖或者通過切割真核起始因子4而引起心肌細胞功能障礙[8]。在CVB3感染后期，促炎細胞因子和趨化因子會大量表達而引起過激炎癥反應，并加重心臟損傷[9]。本文研究發現，小鼠在感染CVB3后體重呈現下降趨勢，但心臟組織炎癥病灶（心肌炎評分）卻呈現增多趨勢，而腹腔注射IL-35表達質?？捎行Ь徑膺@一現象，這提示我們抑制小鼠體內炎癥反應可能是對病毒性心肌炎小鼠病情具有一定的緩解效果。

IL-35是一種由p53和EBI3亞基構成的細胞因子。雖然IL-35在功能和結構上屬于IL-12細胞因子家族，但與現有IL-12、IL-23和IL-27這三種IL-12家族細胞因子來源于巨噬細胞、單核細胞或者樹突狀細胞不同，IL-35卻有Treg細胞合成和分泌[10,11]。同時，研究還表明[5,6,12]，IL-35的主要功能包括抑制Teff細胞增殖、Th17細胞發展以及促進CD4+CD25-細胞的增殖，在炎癥性疾病和自身免疫性疾病中具有潛在的治療前景。本文研究發現，CVB3感染小鼠后IL-35在心臟組織的表達水平與小鼠心肌炎疾病嚴重程度呈負相關，進一步提示IL-35對CVB3誘導的病毒性心肌炎具有潛在的治療價值。

同時，本文研究還發現，IL-35治療可以顯著降低小鼠脾臟因CVB3感染而增加的Th17細胞。Th17細胞是近年發現的除Th1和Th2細胞外的第三種CD4+T細胞亞群，因其可以分泌IL-17而得名[13]。體內研究證實，Th17細胞可以被IL-23刺激而分泌IL-17，進而構成IL-23/IL-17促炎反應軸，因而Th17細胞具有強大的促炎作用，其細胞數量增高是機體高炎癥反應的主要表征之一[14]。Th17細胞作為炎癥反應的重要效應細胞，已被證實參與病毒性心肌炎發病機制，降低Th17細胞數量可以幫助緩解病毒性心肌炎病情[15]。

綜上所述，在心臟組織表達的IL-35可能通過抑制脾臟Th17細胞治療柯薩奇病毒B3誘導的病毒性心肌炎。

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