甲殼素酶的研究進展

徐田甜，侯是媛，齊斌，鄭麗雪，季亞美，李政洪，王立梅*

1(常熟理工學院，蘇州市食品生物技術重點實驗室，發酵工程技術研究中心，江蘇 常熟，215500) 2(蘇州大學 醫學部藥學院，江蘇 蘇州，215123)

甲殼素又叫幾丁質，是由β-1，4糖苷鍵連接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖高分子多聚體[1]，是自然界中唯一的天然帶正電荷的多糖，每年自然界中儲存量超過百億噸，僅次于纖維素[2]。但甲殼素分子量極大，不溶于水，只溶于濃酸，這極大地限制了甲殼素的應用。目前降解甲殼素生成甲殼低聚糖的方法主要有化學法、物理法和酶法等?；瘜W法主要有酸解法和氧化法，這2種方法反應條件比較嚴苛，反應產物不均一，產品穩定性差，對環境污染嚴重。物理法主要是利用微波、超聲波等產生巨大能量使得β-1，4糖苷鍵等化學鍵大量斷裂從而生成低分子量的甲殼低聚糖，其產品均一，穩定性好，對環境污染少[3]。VASILIEVA等[4]利用低溫電子束等離子體(EBP)降解甲殼素，研究表明EBP對甲殼素的作用降低了其結晶度指數和聚合度。但物理方法生產成本比較高，應用于工業化生產可能性較低。酶法則是通過專一性或非專一性酶水解甲殼酶，非專一性酶包括纖維素酶、溶菌酶、脂肪酶等。甲殼素酶是降解甲殼素的專一性酶，能斷裂甲殼素的β-1,4糖苷鍵使其水解生成N-乙酰葡糖胺[5-6]。與非專一性酶作用比較，專一性甲殼素酶酶解法反應溫和，產品均一，對環境沒有污染，大量節省生產成本和時間。因此，專一性甲殼素酶越來越受到人們的重視，本文主要對甲殼素酶的研究現狀進行綜述。

1 甲殼素酶的來源

能產生甲殼素酶的生物很多，包括微生物、動物、植物等。1905年，BENECKE首次發現幾丁芽孢桿菌(Bacilluschitinovirous)能分解利用甲殼素[2]。1921年，FOLPMERS發現某些細菌和真菌能利用甲殼素在瓊脂平板上形成水解圈，進而證明了甲殼素酶的存在[2]。1929年時，KARRER和HOFFMAN又在蝸牛體內發現了甲殼素酶[2]。之后，人們發現有一些病毒也能產甲殼素酶。

近年來，對產甲殼素酶的微生物研究越來越多。產甲殼素酶的微生物包括細菌、放線菌和真菌等，其中主要包括粘質沙雷氏菌、芽孢桿菌、假單胞菌以及鏈霉菌等[7-10]。LU等[11]從黃瓜根部分離到1株新型稀有放線菌SaccharothrixyanglingensisHhs.015，將甲殼素酶的基因片段在大腸桿菌中過表達，產生的可溶性蛋白Chi6769(77.9 kDa)對真菌蘋果腐爛病菌(Valsamali03-8)有強烈的抑制作用。SONG等[12]在腐爛蘑菇的土壤里分離到1株新型的耐冷甲殼素酶生產菌Pedobactersp.,25 ℃下，其產生的甲殼素酶的酶活最高，該甲殼素酶對立枯絲核菌和灰葡萄孢菌的抑制率分別達到60.9%和57.5%，這種甲殼素酶PR-M6在低溫下防治植物病原體表現出了極大的潛力。BOUACEM等[13]研究發現嗜熱氫化嗜麥芽寡頭菌株KB-DZ44中能產耐高溫的甲殼素酶ChiA-Hh59，純化后的甲殼素酶在60 ℃溫育36 h后其最大酶活為3 000 U/mL。

2 甲殼素酶的分類

甲殼素酶有多種分類方法，可根據其分泌性、切口位置、等電點以及氨基酸序列的不同來分類。

2.1 分泌性

根據甲殼素酶的分泌性可分為胞內甲殼素酶和胞外甲殼素酶，絕大多數的微生物所產的甲殼素酶都為胞外酶[14]。因此在做甲殼素酶菌株篩選時，大多采用比較水解圈大小來選擇目標菌株。這種甲殼素酶都是屬于誘導型的，即在底物甲殼素的誘導下向胞外分泌酶來降解底物生成殼寡糖或單糖再進行利用[2，15]。

2.2 切口位置

根據甲殼素酶的切口位置以及初級產物不同，可以分為甲殼素內切酶和甲殼素外切酶。甲殼素內切酶從甲殼素糖鏈內部隨機切斷，水解產物為二糖或寡糖等[16]。而甲殼素外切酶是從甲殼素的非還原端依次切斷得到單糖[17]。

2.3 等電點

按照酶等電點的不同，可以將甲殼素酶劃分為酸性、中性和堿性甲殼素酶。微生物產的甲殼素酶多為酸性酶，而植物產的甲殼素酶多為堿性酶，也有少部分產酸性酶，且二者有可能出現在同一植株中[18]。

2.4 氨基酸序列同源性

根據氨基酸序列的同源性，甲殼素酶被分為18和19兩個家族。18家族的甲殼素酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，而19家族的甲殼素酶主要存在植物內，在少部分放線菌中也有存在。18家族的甲殼素酶的催化區域都包括2個Asp和1個Glu，其應該為18家族甲殼素酶的關鍵活性氨基酸[19-20]。18家族甲殼素酶的水解產物與19家族甲殼素酶的水解產物完全不同，18家族的甲殼素酶的水解產物都是β異構體，而19家族的甲殼素酶的水解產物均為α異構體[18]。18、19家族的甲殼素酶的催化機制差別也很大，且完整的催化機制有待進一步研究[20-21]。

3 甲殼素酶的分子生物學研究

在甲殼素酶的分子生物學研究中，研究最多的為甲殼素酶基因的克隆表達，通常將細菌甲殼素酶基因在大腸桿菌系統中表達，將真菌甲殼素酶基因在酵母系統中表達。而常規來源的篩選方法并不能快速地篩選到高效產酶基因。因此有部分研究者采用隨機突變的方法進行高通量篩選或對基因定點突變，從而篩選到優良性狀的產酶基因。為了研究甲殼素酶的功能和性質，部分研究者通過構建基因缺失突變體來進行研究。

3.1 隨機突變

CHEN等[22]為了提高來自秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的甲殼素酶的降解能力和殺死線蟲的活性，通過易錯PCR技術構建了一個隨機突變體文庫進行高通量篩選。突變型甲殼素酶的半數致死濃度與野生型相比降低20%，殺死線蟲的活性大大提升。研究還發現，突變型甲殼素酶減少了底物與底物結合位點Asp141之間的距離，最終導致底物親和力，催化效率和比活性的增加。

3.2 定點突變

定點突變是一種高效快速改變目的基因表達蛋白的產量和性狀的方法，通常采用PCR的方法向目的基因中引入所需的變化，通常為堿基的替換、增減等。FAN等[23]研究發現Lymantriadispar幾丁質酶中的2個天冬氨酸殘基(D143，D145)和1個色氨酸(W146)是在家族18幾丁質酶催化區的第2個保守基序內觀察到的高度保守的殘基，其從L.dispar克隆了幾丁質酶cDNA LdCht5，并且使用定點突變的方法用其他3種氨基酸分別、組合、全部取代3種殘基制備7種突變型甲殼素酶，研究發現突變酶酶活穩定的pH范圍變廣，在特定pH值下，突變型甲殼素酶的穩定性優于野生型。

3.3 基因缺失突變體

反向遺傳學經常通過制備目的基因功能缺失突變體來研究該基因的功能，CRISPR/Cas9工具基因編輯工具以及RNA干擾技術是目前常用的制備方法[24]。SUN等[25]利用CRISPR/Cas9工具敲除脊尾白蝦的幾丁質酶基因(EcChi4)來制備EcChi4基因的功能缺失體從而研究EcChi4基因的免疫防御功能。研究發現，在受到副溶血性弧菌或嗜水氣單胞菌攻擊時，EcChi4缺失組的蝦的死亡率顯著高于野生型組，由此證明EcChi4基因具有免疫防御功能。RNAi(RNA干擾)是通過序列特異性方式沉默靶基因的技術。GANBAATAR等[26]選擇幾丁質酶基因作為靶基因，將靶基因的干擾序列克隆到L4440載體中以產生序列特異性dsRNA(雙鏈 RNA)，將重組L4440載體轉化入大腸桿菌菌株 HT115(DE3)中，將基因工程菌直接喂養給受體昆蟲Mythimnaseparata。研究發現口服大腸桿菌表達的dsRNA的受體昆蟲也會發生RNAi效應，M.separata內源性基因表達被沉默，M.separata的甲殼素酶基因缺失突變體的死亡率增加和幼體體重下降。上述研究結果表明甲殼素酶具有抑菌活力，提高免疫防御以及促進昆蟲發育等功能。

4 固定化甲殼素酶

為了使甲殼素酶廣泛應用于工業化，其固定化研究也越來越受人們關注。MOHAMMADZADEH等[27]將純化的Chit36酶固定在Ca2+交聯的海藻酸鹽/海泡石(AlgSep)納米復合物珠粒中，以改善生物催化過程期間Chit36酶的催化活性和穩定性，研究發現藻酸鹽納米復合物珠中的Chit36的催化活性比不含海泡石的藻酸鹽珠粒中的固定化Chit36高，該項研究在制藥等工業上具有廣泛的應用前景。

5 甲殼素酶的應用

5.1 農業

甲殼素酶具有抗蟲和抗真菌作用，由于真菌細胞壁和昆蟲骨骼中都含有大量的甲殼素，在甲殼素酶的作用下水解甲殼素造成真菌和害蟲的死亡[28-30]。甲殼素酶可以用來解決由害蟲和真菌作用導致的農作物減產問題，同時不會對環境造成污染和損害。用幾丁質酶分解植物病原體進行的生物防治在農業中的應用越來越受到重視。GURAV等[31]從貝類加工工業土壤中分離出2種不同的菌株RST25和SUK25可以分解甲殼素，RST25酶活較高并被鑒定為短小芽孢桿菌，在體外測定中，短小芽孢桿菌RST25能顯著抑制植物病原菌Fusariumsolani和Aspergillusniger，短小芽孢桿菌RST25及其產生的幾丁質酶可以作為抗真菌植物病原體的生物防治劑。除此以外，將甲殼素酶基因轉化到農作物中構建轉基因食品的研究越來越受到人們的關注。KHAN等[32]通過農桿菌介導的轉化方法將甲殼素酶基因重組到馬鈴薯內開發了過表達內切幾丁質酶基因的轉基因馬鈴薯(品種Desiree)，研究表明轉基因馬鈴薯能顯著抑制植物病原真菌包括鏈格孢菌(Alternariasolani)的生長。KHAN等[33]將甲殼素酶基因(NiC)轉化到甘藍型油菜中，發現轉基因甘藍型油菜能抑制常見真菌病原體交鏈孢菌(Alternariabrassicicola)的活性?？拐婢D基因食品對環境的影響廣受關注。KHAN等[33]研究發現轉基因甘藍型油菜與非轉基因甘藍型油菜之間的土壤酶活性沒有明顯差別，對根際土壤進行微生物多樣性分析發現NiC甘藍型油菜品系可能不會影響根際土壤的微生物活性和群落結構。品種之間根際土壤進行微生物多樣性的差異可能是測試參數的微小變化導致。甲殼素酶轉基因農作物能有效抵抗植物病原體的侵害，大大提高產量，同時并未對環境造成影響，具有很廣闊的農業應用前景。

5.2 畜牧業

自然界中甲殼素含量很高，但目前對甲殼素利用度很低。含有甲殼素的生物體被認為是新型動物飼料資源，但動物無法消化甲殼素，這就極大地限制了甲殼素在畜牧業上的應用。TABATA等[34-35]研究發現酸性甲殼素酶(Chia)可以在小鼠，雞和豬胃組織中高度表達，并且它可以在動物的胃腸道(GIT)中消化甲殼素，且酸性甲殼素酶(Chia)可以對胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白水解活性產生抗性，這意味著在動物胃中成功表達的甲殼素酶并不會輕易被蛋白酶水解。酸性甲殼素酶可以作為動物飼料添加劑，可以將甲殼素制成動物可食用飼料，提高甲殼素利用率。

5.3 工業

甲殼素酶的工業化生產一直是人們的研究重點。KIDIBULE等[36]將來自Trichodermaharzianum的甲殼素酶Chit42基因在巴斯德畢赤酵母中表達，采用分批補料的發酵方法，甲殼素酶的產量可以達到約3 g/L。KIM等[37]在從韓國本土小牛糞便中分離出幾丁質酶Escherichiafergusonii菌株，在pH值為7.0和30 ℃的最適條件下，深層發酵幾丁質酶活達到最大，為7.24±0.07 U/mL。在這項研究中，發現蔗糖，酵母提取物，(NH4)2SO4和NaCl可能會提高外切幾丁質酶的活性。AOUNALLAH等[38]運用響應面法優化地衣芽孢桿菌AT6菌株(BacilluslicheniformisAT6 Strain)的發酵培養基，將初始甲殼素酶的酶活提高近10倍達到505.26±22.22 mU/mL。目前對甲殼素酶的工業化研究都集中在提高甲殼素酶的酶活上，對利用甲殼素酶生產殼寡糖的研究較少。

6 展望

甲殼素酶具有良好的抗菌抗蟲特性，在生物防治上具有廣闊的應用前景。甲殼素酶還能快速降解甲殼素幫助生物體消化利用甲殼素，提高自然界中甲殼素的利用率。而工業化生產穩定性好、酶活高的甲殼素酶是一直困擾人們的難題。因此，人們從工業發酵條件、固定化方法、異源表達高產酶基因等方面進行研究，以促進發展甲殼素酶工業化步伐[39-40]。

目前，雖然甲殼素酶已經商業化，但其發酵水平較低，發酵成本較高，這將限制甲殼素酶的廣泛應用。一方面，要尋找甲殼素酶新的來源和低價培養基，在提高甲殼素酶發酵水平的同時降低發酵成本；另一方面，要深入研究利用甲殼素酶發酵生產殼寡糖的技術，提高酶法產殼寡糖的產量和純度。